2021-07-28百万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序显示目的基因已连在载体上，菌落PCR也可以P出目的条带，为什么双酶切只有一条带！！！！

Is the construct maxiprep sequenced? If it is, have you tried sequencing using primers the nucleotide sequence of which is derived from the insert DNA?

试过的，分别涉及两对引物，一对在插入的目的基因上，一对在载体上，做质粒PCR都可以P的出目的条带，但是再做双酶切，都只有一条带。

Canyoufindthetwoenzymesitesinthesequencedata?

是不是连接后没有酶切位点？我之前做的单酶切，连接目的基因后，又做的酶切，通过没有酶切成线性质粒，证明我的目的基因连接上了。跟你的思路完全相反。仅供参考。

会不会是其中一个酶切位点发生了突变或者甲基化导致切不下来?

重新连接后的目的序列，经测序分析，双酶切位点都还在的。谢谢各位，已找到原因。

您好，我是新手，最近遇到了与你一样的问题，请问你是怎样找到问题所在的呢？？