测序酶
宝石橙蛋白染色试剂,SYPRO orange protein stainSYPRO orange ...
zhoushanxin2021-08-06
正在做bmp4启动子的一段序列,两端分别加的Sac1和Nhe1的位点,pcr之后跑胶显示条带位置正确,回收后分别与pgemt-easy载体和peasy-t5zero载体连接,连接之后单酶切和双酶切均显示连接成功,但测序结果就是不对,已经测了3次,求哪位大神指教一二,多谢了!!难道真的是pcr出的序列本来就是错的?而且连接peasy-t5zero载体后双酶切切不开。我用的Sac1和Nhe1是Thermo的,正在尝试换takara的重新双酶切。pgem-teasy载体插入片段位点两侧各有一个EcoR........
【求助】PCR双酶切讨论
sunshinewfu2021-08-05
两个基因大小分别230kb和450kb,酶切后,450kb的有目的条带,但很弱,230kb的质粒条带亮,其下方有一很微弱条带,用的酶分别是:Ncol和Spel体系是(Takara,两个酶切体系不同,用的官网推荐体系):NcoI1μlSpel1μl10×KBuffer2μl0.1%BSA2μlDNA3ul灭菌水upto20μl37℃4h电泳1h.....
利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法
小泥人-墨点2021-08-03
我的目的蛋白D2,是膜表达蛋白,构建了三种载体的重组质粒,分别为CMV,pCDNA3.1,pEGFP-N1,三个重组质粒酶切正确、测序正确,也曾表达过,可以砸出相应大小的目的条带。大提过后,有近一个半月没有进行转染表达,突然发现我的质粒不能砸出目的条带了,甚至外源性的anti-Flag都砸不到(pEGFP重组质粒转染可以观察到微弱荧光,比以前较少),已经重修小提过,也重新进行了酶切,进行测序,都没有问题,现在就是砸不到条带(阳性对照的Flag每次都可以),请各位大神帮忙!!!!!!!!!!!!!........
为什么双酶切有目的片段测序却没有
momo6022018792021-08-01
利用NheI和HindIII双酶切插入目的片段,为什么双酶切有目的片段和切开的质粒,测序却没有?并且测序后在NheI位点后的序列变成了-GGCTAGGTAC-Kpn位点(CGTTTAAACTTAAGCTTG消失。之前和之后的序列都相符),之间的怎么都没了?.....
【求助】测序成功的重组质粒酶切后得不到目的条带_问答详情_测序...
yaobiye2021-07-30
我的实验中,为了检测一个明确报道的多态性位点(该位点为酶切位点)在细胞中的多态性状态,能不能用高保真酶扩增含该位点的一段序列后,直接测序?还是应该先做酶切,在测序?测序是需要做一个t载体克隆不?期待着高手们的指点,谢谢。.....
重组质粒酶切鉴定及PCR实验
dxy_20y4ry492021-07-28
1、目的基因与质粒载体(pET21b)双酶切连接,转DH5a感受态细胞,挑取单菌落,菌落PCR可以P出目的条带(引物是pET21b载体上设计的),扩大培养,提取质粒,但是双酶切只有一条带,测序显示目的基因已连在载体上,双酶切了很多次,都切不出来目的条带,也不是酶切体系(20-100ul都尝试过)和酶切时间(3-4h,过夜都试过)的问题。求高手指点,到底哪里出问题了!!!.....
KPOP Ktown4u 官方网站 : 神话(SHINHWA)
鳄鱼妹2021-07-27
构建重组质粒,在pSET4S质粒上插入一段基因的上下游同源臂,双酶切验证正确,同时以重组质粒为模板PCR扩增插入的片段,均与阳性对照一致,但测序结果进行NCBI比对,发现插入的一段序列不正确。而且这个重组质粒曾经构建出来过,因其中一个碱基突变所以重新构建,使用了primestar重新构建却总是测序不正确或者酶切不正确.....
...质粒酶切只有一条带,测序显示目的基因已连在载体上,菌落PCR也...
xiaoyuer66882021-07-25
最近在构建质粒,遇到奇怪的问题,向大牛们求助!!通过CDNA文库扩增目的基因片段后连接至载体上,转化后挑取克隆进行菌落PCR鉴定,选择阳性菌落扩增后提取质粒,再将质粒酶切鉴定,选择酶切结果正确的质粒送测序,通用引物测序结果显示上游测序结果为载体序列,无目的基因序列,下游引物无信号?!崩溃了,为嘛!我同一批做的其他几个质粒都没有问题,这个质粒构了两次了都这样。。。欲哭无泪啊,求大神们慷慨相助!!.....
目的片段双酶切后连接载体,测序结果是连反了,为什么会这样?_问答...
huangmwone2021-07-23
目的片段用kpn1和xho1双酶切,然后连接到PGL4.10上,结果用RPV3测序出来目的序列是反向互补的,这是什么原因导致的?.....
DNA测序的原理?基因组测序的原理?
小飞ur52017-10-03
高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(Next-generation sequencing technology),以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等,主要有以下几种:大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸测序(454 p........
二代测序过程使用哪些酶
小天才DM00L2017-10-03
没有专门的“测序酶”的说法。 你所说的“测序酶”在一般情况下就是“聚合酶”。因为目前的的测序方法主要就是借助聚合反应。当然,有些测序方法(比如曾经的SOLiD系统)是利用连接反应,那么它用的“测序酶”肯定是连接酶。估计,也就是这个原因有人把它。.....
蛋白质测序 实验方法
℡欠诚灬2017-10-03
●目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶(proteolytic enzyme)或称蛋白酶(proteinase)已有十多种。●应用酶水解多肽不会破坏氨基酸,也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。向左转|向右转.....
为什么在聚合酶链反应(PCR)中要严格控制温度,而且要使用耐高温...
末日审判丶济璬2017-10-03
PCR程延伸阶段温度升72摄氏度左右高温度所溶液四种脱氧核苷酸需要耐高温Taq DNA聚合酶作用据碱基互补配原则合新DNA链.....
DNA sanger测序法原理
专心学生物2017-10-02
为甚么只有加法系统不行?最好举例说明,谢谢!!!.....