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NARAM的博客_

mayitao /发布时间:1630085406 /浏览量:242

SNP是遗传学研究是不可缺少的一部分，目前成熟的SNP分型方法有很多，各有各的特点和适用性，其中直接测序法是堪称为“金标准”的一种手段。但其由于受到分型通量及分型成本的限制，无法在大规模的分型项目中得到推广，因此随之产生了基于二代测序发并结合多重PCR技术的高通量SNP分型法。
随着二代测序技术的普及，相比Sanger测序，二代测序降低了测序读长，但是大大增加的测序通量同时大幅降低测序成本。利用二代测序进行SNP分型，不仅测序读长满足分型需求，可以同时对数十数百个位点，上千样本进行分型。二代测序结果判断准确，相比RFLP，Taqman，LDR等方法都通过间接结果来进行分型结果的判定，但是直接测序或二代测序法分型能都直接看到具体序列情况，SNP位点判断更加直观。
分型原理图

SNP位点捕获
二代测序法主要通过PCR的方法，对目标SNP位点进行特异性捕获。为了提高分型的通量，目前主要采用多重PCR的方法同时对多个位点进行捕获（可同时对1-100位点进行分型）。

图一多重PCR的多SNP位点捕获

样本标签添加
由于二代测序通量是足够满足数百数千样本的同时测序，因此需要对不同的样本添加唯一的样本标签（Barcode），从而在后续数据分析过程中，能够进行样本拆分。
因此在多重PCR完成第一轮多SNP位点捕获后，需要进行第二轮PCR，在第一轮PCR产物的基础上，添加样本样本标签及测序接头等序列。通过PCR条件优化，目前亦可实现一次反应，两轮PCR接力完成的效果。

图二添加样本标签序列

结果判读
上机测序后，每个样本同一个SNP位置可以读到数十或数百条reads（具体取决于测序通量），并且能够清晰看到每条序列的具体信息，通过对SNP位点的聚类分析，实现位点基因型的判断。

图三SNP位点序列情况

下图为大规模样本中二等位基因reads比分布结果，每一个点代表一个样本一个SNP位点的聚类结果，两端表示纯和，中间表示杂合（理想情况，1/0表示纯和，0.5表示杂合）。

图四位点聚类分析结果图

二代测序法技术特点

上海翼和生物自主研发的超高重PCR技术，扩增引物经修饰及优化，克服了传统多重PCR扩增效率不均一问题，95%以上扩增子的测序深度在平均测序深度的0.2X范围，保证测序通量的有效利用。

基于超高重PCR技术平台的高通量二代SNP分型服务，适用于多种遗传学研究领域，如疾病与基因的关联分析，临床分子诊断研究，QTL定位及分子育种等大规模多位点大样本的SNP分析。

上海翼和应用生物技术有限公司

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