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蚂蚁淘  /发布时间:1545759249 /浏览量:226   

DNAPlasmidPrep.

ThisisascaledupversionoftheBaronprotocolwhichhasbeenmodifiedtoachievepuritycomparabletoCsClpreps.IhavenotsortedoutstrainvariationsyetbutHB101workswell.

Solutions

SolutionI

1%glucose10gglucose

25mMTrispH8.025ml1MTrispH8.0

10mMEDTA20ml0.5MEDTApH8.0

upto1literwithQ

storeat4o

SolutionII

1%SDS2.5ml20%SDS

0.2NNaOH1.0ml10NNaOH

upto50mlwithQ

makefreshasneeded

SolutionIII

25%potassiumacetate250gpotassiumacetate

add150mlglacialaceticacidandbringupto1liter

withQ

storeat4o

PEG8000

40%PEG8,00040gPEG8,000

upto100mlwithQ

storeatroomtemperature

Procedure

•Spindown5mlofaovernightculturein3Eppendorftubesat14KandpoolthesamplesbyresUSPendingin200mlSolutionIcontaining1mg/mlLysozyme(Sigma#L6876)onice.

•Immediatelyadd400mlSolutionII,followedby300mlSolutionIIIandspinat14Kfor5-10".

•Followingthespin,remove600-700mlofthesupernatantandadd500mlphenol/chloroform;mixandspinat14Kfor5".

•Remove600mlsupernatant,topoffwithcoldEtOHandspin10"atroomtemperature.

•Washwith80%EtOH,dryandresuspendin60mlTEplus1mlRNaseA(10mg/ml);incubateat37°for10".

•Add50mlphenol/chloroformandspinfor2",remove50mlsupernatantandadd10ml5MNaClplus21ml40%PEG8000.

•Incubateonice5",spin5"atroomtemperatureandresuspendin90mlQ(forpUCoriIgetapprox.0.2-0.5mg/ml).

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