我上个月做了mating（酵母双杂交的一种办法）。
现在已经做到了，X-galassay。
从230多个克隆里第一次选出了68个蓝色克隆。
第二次挑选出了74个蓝色克隆。
可是，对比发现重复变蓝的只有11个。

WhatcanIdoforitNEXT~

我的具体步骤是。

一：文库建立

1.mammaliancelltotalRNA-->PolyARNA-->dsRNA-->提纯dsRNA。
2.将提纯的dsRNA转染到AH109细胞株,涂在150ㅠ待3~5天克隆出现并长势饱满.
3.每个150ㅠ，放入5mlfreezingmedia，将细胞收集在一起，均匀混合，1ml分装，-70度保存。

二：酵母双杂交

1.mating,matingproduct分别涂在40个TDO（SD/-H-L-T），10个QDO(SD/-A-H-L-T)。
2.matingefficiency3%大于下限值2%。
3.实验步骤说明上，说3-8天克隆会出现。可是我的大概12天才长了出来（TDO）。
小心的将TDO上长出来的280个克隆，转移到TDO。
　再次培养了４天左右　发现　21个在转移后没有继续长，所以淘汰掉。
４．将TDO上的克隆，转移到　QDO　（forstronginteractionassay）／　牙签上　剩下的一点点细胞　划在了100ㅠ的TDO(forcolonyX-a-galfilterassay)。　双重选择，在QDO上生长，并在X-a-gal筛选中变蓝的克隆。
5.以上方法，选出223个在　QDO　上生长的克隆。
6.X-a-galfilterassay两次。　

到这里　问题出来了　从230多个克隆里第一次选出了68个蓝色克隆。
第二次挑选出了74个蓝色克隆。
可是，对比发现重复变蓝的只有11个。
而且，书上说　X-a-galfilterassay最多不要超过８小时。
可是我的克隆，基本都是在６－８小时之间　变蓝的。

请大家　一起分析一下，怎么两次　X-a-galfilterassay　变蓝的差距这么大。
难道，都是假阳性？？

我首先将两次实验重合的　11个克隆的　plasmidDNA提了出来，正在测序。

剩下的怎么办？　11个也太少了，之后的实验，怎么办？　有必要　再作一次　X-a-galfilterassay么？？　要是，又发生么变化，怎么办？？

拜托各位！！　！