大规模酵母双杂交筛选

今天小编要介绍的是高通量法酵母双杂交，即大规模的酵母双杂交筛选方式。不卖关子，按照其筛选方式一般分为三种：文库筛选法；阵列筛选法；两步法。

文库筛选法

文库筛选法一般用相对较少的已知或未知诱饵去筛选相对较大猎物库,也可以在诱饵筛选出阳性猎物后,再以猎物为诱饵筛库,如此循环,不断扩大图谱。诱饵可以一个或数个至数千个,可以是ORF、全长CDNA或它们的片段(含结构域);猎物库一般很大,可以是众多ORF集合成的库,也可以是全长cDNA库或cDNA片段库,或随机基因组片段库。文库筛选法优点是可以得到相互作用的结构域信息和降低假阴性率,但同时也可能提高假阳性率。

阵列筛选法

阵列筛选法又可分为一对一阵列、高通量阵列法、亚库对亚库法。一对一阵列法含有不同BD-X的菌株和所有含不同AD-Y的菌株一一对应筛选。

高通量阵列法是把所有不同ORF-AD集合成库,然后与排成阵列的不同BD-X作用的筛选方法,其实质是诱饵数量较大情况下的阵列化文库筛选。亚库对亚库法把总数较大的DBD-X和AD-Y的成员分别编号并分组,每组含一定数量的成员,然后集合每组成员形成亚库(pool),再用猎物亚库对诱饵亚库一一作用,筛选阳性克隆。此法工作量大，获得的阳性克隆的猎物和诱饵都需测序鉴定。

两步法

两步法结合文库筛选和阵列筛选,发挥二者优势。先以单个猎物对诱饵亚库筛选,然后把阳性克隆对应的猎物再同其作用的诱饵亚库的诱饵一对一作用以筛选阳性克隆。

今天重点要介绍的是文库筛选法

目前，欧易生物已将1500多个水稻ORF-AD基因（均为转录因子）转化入酵母单倍体菌株Y187中，构建成了一个无需测序的水稻AD文库。

通过把BD-X转化入另一种单倍体菌株Y2HGold中,然后把分别含BD-X、AD-Y的两种单倍体共接种到液体培养基培养、交配后再接种到二缺板上培养,这样只有含DBD-X和AD-Y的二倍体菌株生长,然后作表型鉴定判断X、Y有无相互作用，可实现简单、高效、大规模的筛选，且筛选到的阳性克隆无需测序。

并可以在诱饵筛选出阳性猎物后,再以猎物为诱饵筛库,如此循环,不断扩大蛋白相互作用图谱。以下是该实验的技术流程图：

1、BD重组质粒进行自激活验证后用SD-trp摇菌过夜；

2、AD文库（欧易生物构建的含1500ORFADpreyvector水稻文库）用SD-leu摇菌过夜活化（使用96孔板）；

3、BD菌株与AD菌株一对一mating（高通量）8-24h；

4、mating后菌液使用复制子涂筛选平板和非选择平板，培养4-6天，得互作子。（此法所获得的互作子，无需测序及酵母回转一对一验证，可通过其他蛋白互作技术进行验证）

今天小编就介绍到这儿，如果您对水稻酵母双杂的高通量筛选感兴趣，欢迎咨询欧易生物。