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mayitao  /发布时间:1630863004 /浏览量:249   

T4DNA连接酶（T4DNA ligase）
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T4DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条DNA双链上相邻的5′磷酸基和3′羟基之间形成磷酸二酯键。可连接双链DNA的平末端、互补粘性末端及其中的单链切口，也能催化RNA连接到DNA或者双链RNA上，但不催化单链核酸的连接。必拓生物采用先进技术研制出高纯度、高品质的T4DNA连接酶，媲美TaKaRa、NEB产品。

必拓®T4DNA连接酶与NEBT4DNA连接酶对比

选择酶切过的载体pNET/XcmⅠ（3.3kb，75ng/μl）和片段F3L（500bp，100ng/μl）用T4DNA连接酶进行连接反应实验，然后转化Top10，统计菌落数，测定阳性率。

一、T4DNA连接酶不同用量数据对比

分别使用必拓®T4DNA连接酶和NEB的T4DNA连接酶进行连接，每10μl体系分别加入连接酶0.2μl/0.5μl/1μl，16℃连接30分钟，连接反应体系如下表（每个连接体系做两个平行管）：

连接体系	必拓®T4DNA连接酶	NEBT4DNA连接酶
载体(μl)	1	1
片段(μl)	0.68	0.68
连接酶(μl)	0.2/0.5/1	0.2/0.5/1
buffer(μl)	2(5X)	1(10X)
总体积	补水至10μl	补水至10μl
连接片段与载体分子数比	6	6

16℃连接30分钟，转化Top10感受态细胞，复苏产物直接取100μl涂板，37℃培养16小时，菌落计数，结果如下（感受态效率为2.07X107）：

酶用量	必拓®克隆数				NEB克隆数
1μl	247	317	平均282	阳性率10/10	64	73	平均68.5	阳性率10/10
0.5μl	80	139	平均109.5	-	58	53	平均55.5	-
0.2μl	68	83	平均75.5	-	47	95	平均71	-

二、T4DNA连接酶不同连接时间数据对比

选取酶切过的载体（pNET）与片段（F3L约500bp）分别使用自产T4DNA连接酶和NEB的T4DNA连接酶进行连接5min、10min、30min，连接产物分别全部转化Top10菌株感受态细胞，连接反应体系如下表（每个连接体系做两个）：

连接体系	必拓®T4DNA连接酶	NEBT4DNA连接酶
载体(μl)	1	1
片段(μl)	0.68	0.68
连接酶(μl)	0.5	0.5
buffer(μl)	2(5X)	1(10X)
总体积	补水至10μl	补水至10μl
连接片段与载体分子数比	6	6

复苏产物直接取100μl涂板，37℃培养16小时，菌落计数，结果如下（感受态效率为2.07X107）：

连接时间	必拓®克隆数				NEB克隆数
5min	35	52	平均43.5	-	21	38	平均29.5	-
10min	26	25	平均25.5	-	15	38	平均17.5	-
30min	39	27	平均33	阳性率10/10	40	36	平均38	阳性率9/10

T4DNA连接酶预混液(LigationMixture)
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必拓生物经优化配方后，特别研发的含有T4DNA连接酶，及连接反应所需各组分的制剂，其中还含有增强连接反应的成分，实验时只需向DNA溶液中加入T4DNA连接酶预混液，即可短时间内高效方便的将载体和外源片段进行连接，反应产物可以直接用于转化。

必拓®T4DNA连接酶预混液与TaKaRa数据对比

反应体系1

反应1	对照1	体积
PCR产物（1000bp）	PCR产物（1000bp）	3.5μl(35ng)
载体pMD19-T	载体pMD19-T	0.5μl(40ng)
必拓®LigationMixture	TaKaRa solutionI	4μl

反应条件：16度连接3小时
转化连接产物：5μl
阳性克隆数

反应	克隆数	阳性率	有效克隆数
反应1	1270	10/10	1270
对照1	1469	8/10	1175

电泳图1：下排是反应1，上排是对照1
  
反应体系2

反应2	对照2	体积
PCR产物（2000bp）	PCR产物（2000bp）	4.5μl(35ng)
载体pMD19-T	载体pMD19-T	0.5μl(40ng)
必拓®LigationMixture	TaKaRa solutionI	5μl

反应条件：16度连接3小时
转化连接产物：5μl
阳性克隆数

反应	克隆数	阳性率	有效克隆数
反应2	3475	10/10	3475
对照2	5150	9/10	4635

电泳图2：下排是反应2，上排是对照2 

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