2021-09-09pet28构建表达载体发生自连？

How is the 240 bp insert DNA generated?

刘昊QC8B构建后双酶切验证，发现载体变的超大5000多变成了8000以上，切出来的片段也不对，我的是240bp的切出来1000多，还特别暗。大家有遇到这个问题么？电泳Marker右边第一个是对照空载体。你可以用载体的通用引物做菌液pcr，不需要做酶切

mparkHowisthe240bpinsertDNAgenerated?是用pcr出来的，设计的双酶切引物，pcr后试剂盒纯化然后双酶切，试剂盒纯化，然后t4连接酶连接。

徐鹏程2QTW你可以用载体的通用引物做菌液pcr，不需要做酶切我是用的自己引物菌液pcr都出来了，然后去测序不对然后提质粒验证了一下，不对。

The420bpPCRfragmentcanbebluntendedandthenusingbluntendingligationtocloneintopUCorpBlueScriptfirst.Afterscreeningandsequencingconfirmation,cutofftheinsertandcloneintopET28.

mparkThe420bpPCRfragmentcanbebluntendedandthenusingbluntendingligationtocloneintopUCorpBlueScriptfirst.Afterscreeningandsequencingconfirmation,cutofftheinsertandcloneintopET28.thankyou我今天做了新的酶切并且用切之前的做了对照发现pet28b切之后的大小变得很大得8000以上而对照是5000多正常的，是不是我酶切的问题啊？

Manythingscanhappen.Redothecloningandclonethe420bpPCRproductinbluntendingligation.

mparkManythingscanhappen.Redothecloningandclonethe420bpPCRproductinbluntendingligation.OK我试试

谢邀，不过实验室的东西真不太懂。。主要还是做一些数据处理、画图之类的工作；

最后说一下结果，双酶切切出来的质粒跑电泳就是很大，正常连接就好了，我最后用的bamh1和ecor1已经成功四个了