1.制备澄清的重组蛋白溶液（见基本方案步骤1～5)。

2.轻轻的重悬谷胱甘肽琼脂糖珠，将其倒入适当的层析柱中，使树脂自然沉降，柱中液体流尽，然后用3～5倍的PBS洗涤缓冲液洗柱2次，以去除附着的乙醇。让柱中液体流尽。

3.将澄清的重组蛋白溶液上柱，调整柱的流速至最大为5ml/min每ml琼脂糖珠。保存每份流出液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，防止超出了谷胱甘肽的结合能力。

4.用5倍床体积的PBS洗涤缓冲液洗柱，让柱中液体流尽，弃洗液。

5.将3倍床体积的GST洗脱缓冲液上柱。调至最大流速为5ml/min每ml琼脂糖珠。让柱中液体流尽，分别收集洗脱液。可选择加入150mmol/L的NaCl、5mmol/LCaCl₂（或对于有些蛋白质为5mmol/LMgCl₂）和0.1%2-巯基乙醇，这对某些蛋白质的可溶性是需要的。

6.将自由的谷胱甘肽在100倍体积的50mmol/LTris·Cl（pH8.0），4°C透析>4h。2h后更换透析液。

7.每毫克含有凝血酶酶切位点的纯化GST或6×His融合蛋白加入200μg（10个凝血酶单位）牛凝血酶。

8.混合，在室温下放置12h以上。

9.在酶切反应结束后，加入2倍体积50%的谷胱甘肽琼脂糖珠。

10.4℃，放置30min。4℃，5000g离心10min。将上清放在-80℃保存。