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| 实验材料 | 肌肉肌球蛋白 试剂、试剂盒 | 焦磷酸钠柱平衡缓冲液柱缓冲液高盐缓冲液肌球蛋白-DEAE透析缓冲液 仪器、耗材 | SDS-PAGE
实验步骤 | 一、准备DEAE柱和材料 1.准备贮存液和材料 200mmol/L焦磷酸钠（NaPPi)，pH7.0 用HCl和H3PO4调NaPPi溶液的pH值 2x柱平衡缓冲液： 40mmol/LNaPPi，pH7.0 2mmoI/LDTT 6mmol/LNaN3 2.把DE-52悬浮在15倍体积的0.5mol/LHCl中，搅拌30分钟。 3.用dH2O洗DEAE直至pH超过4.0。 4.在15倍体积的0.5mol/LNaOH中悬浮DEAE，搅拌30分钟。 5.用dH2O洗DEAE直至pH为8.0。 6.重复酸和dH2O这两步（步骤2和3)。 7.用浓缩的（2x)柱缓冲液滴定到合适的pH值。 8.用1x柱缓冲液平衡DEAE。 1x柱缓冲液： 20mmol/LNaPPi，pH7.0 1mmol/LDTT 3mmol/LNaN3 10倍体积的缓冲液换3次可能比较合适，但是平衡与否应该通过比较起始平衡缓冲液和从沉降了的柱床上取的上清的电导率和OD280值来检验。 9.用平衡了的DEAE准备一个2.5cmx60cm的柱子（用合适的管路）。 10.用合适的管路做一个1L的梯度生成器（每个杯子1L）。 (1)加大约1.05L1X柱缓冲液到梯度生成器的杯子中。 (2)通过瞬时打开阀门然后关上来赶走阀门和管路中的空气。 (3)在另一个杯子中加1L高盐缓冲液。 高盐缓冲液： 20mmol/LNaPPi，pH7.0 1mmol/LDTT 3mmol/LNaN3 其中含0.5mol/LNaCl (4)去掉多余的缓冲液使梯度生成器两边的溶液高度相等。 (5)在产生梯度前打开杯子间的阀门。 (6)从梯度生成器的低盐和高盐杯子中保留小部分样品。使用这部分样品来校正电导率测量值，这样就可以通过组分的号码或体积来知道梯度的盐浓度。 二、用柱层析来纯化肌球蛋白 1.取60mg用前面的方法获得的肌肉肌球蛋白在肌球蛋白-DEAE透析缓冲液中透析。 肌球蛋白-DEAE透析缓冲液： 40mmol/LNaPPi，pH7.0 1mmol/LDTT 3mmol/LNaN3 2.在以上述方法准备的2.5cmx50cmDEAE柱上加60mg肌球蛋白（5mg/ml）。 3.流速调整为0.5ml/分钟并立即开始收集组分（穿过峰)。 4.用1x柱平衡缓冲液洗柱子直到洗脱液的OD值和平衡缓冲液的相同（3~5个柱体积）。 5.用平衡缓冲液以0~0.5moI/LNaCI线性梯度洗脱肌球蛋白（2L总体积，如上面步骤10所述配制），收集10~20ml组分。 6.用2~3倍体积的高盐（柱平衡缓冲液中含1mol/LKCl）洗柱子来洗脱所有残余的结合蛋白。 7.检测组分的电导率，蛋白浓度，并通过SDS-PAGE检测多肽组成。
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