Western杂交

l 组织印迹的Western杂交

在硝酸纤维素膜上制备组织印迹

1．在塑料板上放置两层Whatman 1号滤纸，在滤纸上方放上一张普通纸，然后铺上一层硝酸纤维素膜。

2．用双面刀片从植物组织如大豆的茎上切取一块切片（厚度约为1mm）。如果组织表面是湿的，则在Kimwipes纸上轻轻吸干或用蒸馏水洗涤几秒钟然后再用Kimwipes纸吸干。用镊子将组织切片转移到硝酸纤维素膜上，注意一旦将切片放置在膜上以后就不得再移动切片。在切片上放置4层Kimwipes纸，用手指轻轻压15到20秒，用镊子小心拿开纸和组织切片。组织切片经甲苯酸蓝染色后观察其解剖结构。

3．将留有组织印迹的硝酸纤维素膜在空气中晾干。

4．将留有印迹的膜面向下，放入载玻片上的一滴甲苯酸蓝溶液中，对组织切片进行染色。2～3分钟后，吸干多余的染料，用间接照明立刻照相。将载玻片翻转，透过玻璃拍摄染色的组织切片。在切片上粘上几张纸片以免组织切片接触显微镜。

用特定的抗体检测组织印迹中的蛋白质（室温下）

1．在浅碟子里倒入30～40ml洗涤缓冲液I，清洗留有印迹的硝酸纤维素15分钟。

洗涤缓冲液I：

0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)

0.05%叠氮化钠

0.3％ Twen-20

2．将膜转移到15ml印迹缓冲液中，培育3小时。

3．把膜转入10ml用印迹缓冲液稀释的初级抗体溶液中，培育2小时。

4．在40ml洗涤缓冲液I中清洗硝酸纤维素膜10分钟，换上新鲜缓冲液，重复清洗3次。

5．将膜转入10ml用印迹缓冲液稀释的与碱性磷酸酶结合的二级抗体溶液中，培育1小时。

6．在40ml洗涤液I中清洗硝酸纤维素膜10分钟。

7．在40ml洗涤缓冲液Ⅱ中清洗硝酸纤维素膜15分钟，换上新鲜缓冲液，重复清洗1次。

洗涤缓冲液Ⅱ：

0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)

0.05%叠氮化钠

0.3% Tween-20

0.05%十二烷基硫酸钠

8．在40ml洗涤缓冲液I中清洗硝酸纤维素膜10分钟，然后用AP缓冲液平衡10分钟。

AP缓冲液

0.1 mol/L Tris-HCl (pH9.5)

0.1 mol/L NaCl

5 mmol/L MgCl₂

9．在显色反应中，将膜放入10ml含有66μl氯化硝酸蓝四唑和33μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸的AP缓冲液中，两者均为碱性磷酸酶底物。目的蛋白所在处将出现紫色。通常显色10分钟即可获得满意的结果。如果需要更长时间的显色反应，必须在黑暗中进行。

10． 在20ml洗涤缓冲液Ⅱ中清洗硝酸纤维素膜5分钟，终止显色反应。用40ml蒸馏水洗涤5分钟后在空气中晾干。

11． 在解剖显微镜观察组织印迹中被染上色的蛋白质。利用透射光和入射光可成功的观察到蛋白质的定位模式。在入射光下可容易观察到物理印迹。为了确认组织印迹中的蛋白质定位，建议将染色的组织印迹和用甲苯酸蓝染色的组织切片进行直接比较。