注意：这是节选操作步骤，详细英文说明书见http://www.promega.com/tbs/9pim170/9pim170.html本简明操作步骤电子版见www.promega.com.cn cDNA第一链合成操作步骤： 请使用者准备： z重组RNasin®核酸酶抑制剂(目录号N2511)zdATP,10mM(目录号U1201,100mM)zdCTP,10mM(目录号U1221,100mM)zdGTP,10mM(目录号U1211,100mM)zdTTP,10mM(目录号U1231,100mM)z无核酸酶的水(目录号P1193) 1．在一支无核酸酶污染的小离心管中加入： RNA 2ug 引物1ug无核酸酶水补齐至15ul 加热离心管到70℃，5分钟，这样可以打开模板的二级 结构。然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构。短暂离心，使溶液归于管底。 2.按以下顺序在复性的引物/模板管(即以上小离心管) 中加入下列组分： 注意：不要改变引物与mRNA的比例。 M-MLV5XReactionBuffer5uldATP,10mM1.25uldCTP,10mM1.25uldGTP,10mM1.25uldTTP,10mM1.25ul重组RNasin®核酸酶抑制剂25unitsM-MLV反转录酶200units加无核酸酶水补齐至25ul 3.轻弹离心管混合溶液。若使用随机引物，在37℃孵 育60分钟进行反转录反应；若使用其它引物(Oligo(dT)或基因特异引物)，则在42℃孵育60分钟进行反应。 4.第二条链合成可使用您选择的操作方法，也可参考:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.(1989)In:MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,8.64. 注意：M-MLV反转录酶缓存液与许多下游应用相容。 在进行第二链合成或PCR之前，一般无需使用酚抽提及乙醇沉淀纯化合成的第一链cDNA。 普洛麦格（北京）生物技术有限公司电话:8008108133,010********网址：www.promega.com;www.promega.com.cn修改于03/09