产品信息
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产品编号
规格
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价格（元）
HifairTM ⅡReverseTranscriptase 第二代耐热逆转录酶
11110ES92
10000U
-20℃
626.00
HifairTM ⅡReverseTranscriptase 第二代耐热逆转录酶
11110ES93
5×10000U
-20℃
2456.00
产品描述
HifairTM ⅡReverseTranscriptase是在HieffTM M-MLV(H-)ReverseTranscriptase基础上通过基因工程技术得到的全新逆转录酶，与HieffTM M-MLV(H-)ReverseTranscriptase相比，其热稳定性大幅度提高，可耐受高达50℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。HifairTM ⅡReverseTranscriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达10kb的cDNA。
产品组分
编号
组分
产品编号/规格
11110ES92(10000U)
11110ES93(5×10000U)
11110-A
5×HifairTM ⅡBuffer
250μL
5×250μL
11110-B
HifairTM ⅡReverseTranscriptase(200U/μL)
50μL
5×50μL
产品应用
全长cDNA文库构建；终点法PCR；实时定量PCR等。
活性定义
以Poly(A) .Oligo(dT)为模板-引物，在37℃，10min内，将1nmol的dTTP掺入为酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
质量控制
核酸外切酶残留检测：200U本酶和1μgλDNA-HindⅢ，37℃下孵育1h，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：200U本酶和1μg SupercoiledpBR322DNA，37℃下孵育1 h，DNA的电泳谱带不发生变化。
RNase残留检测：200U本酶和1μg小鼠肝脏总RNA，37℃下孵育1h，RNA电泳谱带不发生变化。
运输与保存方法
冰袋运输。-20℃保存。
注意事项
1）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用耗材均需保证RNasefree，以防止RNase污染；
2）所有操作均应在冰上进行，防止RNA降解；
3）为保证高效率逆转录，建议使用高质量的RNA样本；
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
第一链cDNA合成操作步骤
1.RNA变性（此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。）
组分
使用量
RNasefreeddH2O
to13μL
Oligo(dT)18 (50μM)
orRandomPrimers(50ng/μL) 
orGeneSpecificPrimers(2μM)
1μL
or1μL
or1μL
模板RNA
TotalRNA:1ng-5μg或mRNA:1ng-500ng
65℃加热5min，迅速置于冰上冷却2min。简短离心收集反应液后加入下表中的逆转录反应液，并用移液器轻轻吹打混匀。
2. 逆转录反应体系配制（20μL体系）
组分
使用量
上一步的反应液
13μL
5×HifairTM ⅡBuffer
4μL
dNTPMix(10 mM)
1μL
HifairTM ⅡReverseTranscriptase(200U/μL)
1μL
RNaseinhibitor(40U/μL)
1μL
3. 逆转录程序设置
温度
时间
25℃
5min
42℃
30-60min
85℃
5min
【注】：1）当使用RandomPrimers时，需25℃，孵育5min；若使用Oligo(dT)18或GeneSpecificPrimers，此步可省略；
2）逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到50℃；
3）85℃加热5min，目的是使逆转录酶失活。
※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
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