一、材料

1.缓冲液和溶液

醋酸氨（10mol/L)

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V)

2.酶和缓冲液

适当的限制性内切核酸酶

T4噬菌体DNA聚合酶

10XT4噬菌体DNA聚合酶缓冲液

3.核酸和寡核苷酸

含三种来标记的dNTP溶液，浓度各为2mmol/L

含一种未标记的浓度为2mmol/L的dNTP的溶液

模板DNA(0.1~5μg)

4.放射性复合物

[α-³²P]dNTP(10mCi/ml，比活性为800~3000Ci/mmol）

5.专用设备

SephadexG-50离心柱，用TE(pH7.6)平衡

预设定至70℃的水浴

二、方法

1.用产生平端或3突出端的限制酶消化0.1~5.0μg模板DNA。

2.用酚:氯仿抽提及在2.5mol/L乙酸铵的存在下用乙醇沉淀纯化DNA。

3.将DNA沉淀溶于：

10XT4噬菌体DNA聚合酶缓冲液    2μl

2mmol/L三种未标记的dNTP溶液  1μl

10mCi/ml[α-³²P]dNTP

(800~3000Ci/mmol）                   1μl

T4噬菌体DNA聚合酶（2.5单位/μl）1μl

水                                                    加至20μl

37℃温育5min。

4.加入1μl2mmol/L未标记的第四种dNTP溶液，继续温育10min。

5.70℃加热5min以终止反应。

6.用SephadexG-50离心柱层析或在2.5mol/L乙酸铵的存在下进行两轮乙醇沉淀分离标记的DNA与未掺入的dNTP。