注意

：这是节选操作步骤，详细英文说明书见

http://www.promega.com/tbs/9pim170/9pim170.html

本简明操作步骤电子版见

www.promega.com.cn

cDNA

第一链合成操作步骤：

请使用者准备

：

z

重组

RNasin®

核酸酶抑制剂

(

目录号

N2511)

z

dATP

,10mM(

目录号

U1201,100mM)

z

dCTP

,10mM(

目录号

U1221,100mM)

z

dGTP

,

10mM(

目录号

U1211,100mM)

z

dTTP

,

10mM(

目录号

U1231,100mM)

z

无核酸酶的水

(

目录号

P1193)

1

．

在一支无核酸酶污染的小离心管中加入：

RNA

2ug

引物

1ug

无核酸酶水补齐至

15ul

加热离心管到

70

℃，

5

分钟，

这样可以打开模板的二级

结构。

然后立即在冰上冷却，

以避免重新形成二级结构。

短暂离心，使溶液归于管底。

2.

按以下顺序在复性的引物

/

模板管

(

即以上小离心管

)

中加入下列组分：

注意

：不要改变引物与

mRNA

的比例。

M-MLV

5XReaction

Buffer5ul

dATP

,10mM1.25ul

dCTP

,10mM1.25ul

dGTP

,

10mM1.25ul

dTTP

,

10mM1.25ul

重组

RNasin®

核酸酶抑制剂

25units

M-MLV

反转录酶

200units

加无核酸酶水补齐至

25ul

3.

轻弹离心管混合溶液。

若使用随机引物，

在

37

℃孵

育

60

分钟进行反转录反应；

若使用其它引物

(Oligo

(dT)

或基因特异引物

)

，

则在

42

℃孵育

60

分钟进行

反应。

4.

第二条链合成可使用您选择的操作方法，

也可参考

:

Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.(1989)In:

MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpring

HarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,8.64.

注意

：

M-MLV

反转录酶缓存液与许多下游应用相容。

在进行第二链合成或

PCR

之前，一般无需使用酚抽提

及乙醇沉淀纯化合成的第一链

cDNA

。

普洛麦格

（北京）

生物技术有限公司

电话

:8008108133,010********

网址：

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;

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修改于

03/09