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请问有战友也在用BD公司的ELISPOTset试剂盒吗?有些问题想要请教一下大侠们。我按照操作说明的步骤(PBS、PBST、去离子水均过滤)做了2次elispot,无论阳性刺激(我用的PHA刺激的新鲜分离的人PBMC,终浓度为10ul/ml,PHA用于流式时是以刺激细胞产生细胞因子的)孔、阴性孔均没有真正的斑点,而且背景看上去不细致,颜色不均匀(不是大片缺失,看上去有点像用蜡笔涂出来的样子),有没有谁也遇到过这种情况,可能的原因是什么呢。用于封闭和培养细胞的完全培养基(1640+10%FBS+1%双抗)配好后需要过滤吗(我尝试过过滤,可是培养基挺粘,不好虑就放弃了)?我的FBS之前放的-20度,用之前放4度化开的,肉眼没看到任何沉淀产生。还有用于稀释二抗和HRP的10%FBS.PBS配好以后还需要过滤吗(PBS是过滤过的)?之前用看Daclone公司的试剂盒实验步骤需要用70%乙醇预湿PVDF膜,但是BD公司的没有这一步,直接加captureantibody工作液,4度过夜,不知道预湿这一步对背景有没有影响,有做BDelispot时也加上预湿这一步的吗?想到的大概都是这些,语言有些混乱,这一关过不了,后面的实验就无法开展,急得很啊!!急切盼望高手指导!打算明天重新配细胞培养基、PHA按照操作手册再做一次,希望能有好的结果。
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