试剂

5"RACE能否成功依赖于帽子发现接头序列结合在cDNA合成的起始处。这一步依赖于在第一链cDNA末端附加额外的寡核苷酸（dC)。已有证据显示，反转录缓冲液如果存在Mn²⁺，能大大提高这一步的效率（SchmidtandMueller1999)。

第1阶段：反转录产生cDNA模板

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

dNTP溶液（含4种dNTP,各10mmol/L)

TE(10mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)，预热至50°C

2.酶和酶缓冲液

反转录缓冲液，5X(250mmol/LTris-HCl、45°C时pH8.3,30mmol/LMgCl₂，10mmol/LMnCl₂，50mmol/LDTT，1mg/mlBSA)

RNasin

SuperscriptII逆转录酶（Invitrogen)

3.核酸和寡核苷酸

生物素标记的引物P_total(生物素标记的引物可以从Invitrogen订购）。P_total引物的序列见图25-6。

帽子发现接头引物（1mmol/L)。该引物的序列见图25-6。

poly(A)⁺RNA

4.特殊设备

链霉抗生物素蛋白磁性珠（例如Promega的StreptavidinMagneSphereparticles)

磁性分离器（例如Promega的MagneSphereMagneticSeparationStand)

预设为42°C、45°C、50°C、70°C、80°C的水浴或加热仪



二、方法

1.在一个无菌的离心管中，于冰浴上混合以下转录组分。

反转录缓冲液，5X                                 4ul

dNTP溶液（10mmol/L)                          0.4ul

帽子发现接头引物（1mml/L)                    1ul

RNasin(40U/ul)                                         0.25ul

2.在另一个管中，在12ul水中加入lug的poly(A)+RNA和10pmol的Ptotal引物，80°C温育3min,迅速在冰上冷却，在离心机中离心5s，加入第一步的反转录组分。

3.加1ul(200U)的SuperscriptII逆转录酶，室温温育5min，42°C温育30min，45°C温育30min，然后50°C保温10min。

4.70°C温育15min，使逆转录酶失活，用链霉抗生物素蛋白磁性珠分离第一链cDNA,要按照生产商的说明进行操作，链霉抗生物素蛋白磁性珠的用量是所用生物素化的引物的量的5倍。用TE在50°C洗3遍，去掉过量的帽子发现接头（按照生产商的说明）。

5.用TE将反应混合物稀释至0.5ml,4°C保存（这就是cDNA文库）。

第2阶段：cDNA的扩增

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

dNTP溶液（含4种dNTP，各10mmol/L)

2.酶和酶缓冲液

HerculesHot-Start聚合酶（Stratagene)

HerculesHot-Start聚合酶缓冲液（10X)

也可以用其他的热启动PCR系统，例如Roche的ExpandHighFidelity系统。

3.核酸和寡核苷酸

生物素化的cDNA文库（由第1阶段得到）

寡核苷酸引物GSP1和Po(用于3"RACE),或RGSP1和Uo(用于5"RACE),Po和Uo的序列见图25-6

4.特殊设备

可设程序的热循环仪

5.其他

如果需要进行第二轮扩增，在第5步和第6步需要下列试剂。

引物GSP2和Pi(用于3"RACE)，或RGSP2和Ui(用于5"RACE)。Pi和Ui的序列见图25-6。

TE(10mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)

二、方法

1.第一轮

(1)在一个无菌的0.2ml离心管中混合以下组分。

HerculesHot-Start聚合酶缓冲液（10X)      5ul

dNTP溶液（10mmol/L)                         1.0ul

HerculesHot-Start聚合酶                       2.5U
 
H₂0                                                 至50ul
 
(2)加入1ul的cDNA文库（充分重悬磁性珠）和25pmol的GSP1与Po引物（用于3"RACE)，或25pmol的RGSP1与Uo引物（用于5"RACE)。

(3)在热循环仪上98°C加热5min，使第一链产物和链霉抗生物素蛋白变性，并激活聚合酶。冷却至合适的温度退火2min,72°C延伸40min。没有必要在溫育过程中使链霉抗生物素蛋白磁性珠保持悬浮状态，因为生物素不能与变性的链霉抗生物素蛋白相互作用。据报道苯乙烯珠更小，在不搅动的情况下能保持悬浮状态，因此更有优势（Schrammetal.2000)。

(4)按下列程序进行30个扩增循环。



72°C延伸时间一定要根据产物的大小和所用聚合酶的扩增速率进行调整。

2.第二轮（如果需要）

(5)取第一轮的部分扩增产物，用TE以1:20稀释。

(6)用第一轮的程序，但省略掉2min的退火和72°C40mm的延伸步骤，用GSP2和P1引物（用于3"RACE),或RGSP2heU1引物（用于5"RACE)扩增1ul上述稀释材料。