DNA聚合反应需要的原料及操作的方法步骤

在PCR技术中的DNA聚合酶要进行DNA聚合反应时一定要有引子（primer），因为它只能以引子所提供的3-OH为起始点进行延伸（extension）的工作，而不能就地重新合成新的DNA（Denovosynthesis）。一般实验常以人工合成的寡核苷酸为引子进行DNA聚合反应，这时固然可以根据已知序列设计核酸引子，但也可以采用逢机引子（randomprimers）。所谓逢机引子即其序列为逢机序列，不经特别设计，目前应用最广者是以自动化机器所合成的、六到八个核苷酸长的寡核苷酸混合物；反应进行中若有任何一条逢机引子结合到模版DNA，即可引导DNA聚合反应的进行。以randompriming方法进行核酸标定，是以逢机引子引导Klenowfragment（largefragmentofE.coliDNApolymeraseI）进行DNA聚合反应，并在反应过程中添加[α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP等标定物质。而为了避免randompriming也发生于载体部份的DNA，最好不要直接以质体DNA为模版进行标定反应，而应预先将目标DNA自载体切除出来。

仪器用具：微量离心机；沸水浴及冰浴

药品试剂：

模版DNA（pBlueGus的BamHI-HindIIIDNA片段，将由助教提供）

0.2MEDTA,pH8.0

4MLiCl

Randomprimingkit（Roche）：

Hexanucleotidemix（randomprimer）

dNTPmixture（1mMdATP,1mMdCTP,1mMdGTP,0.65mMdTTP,0.35

mMDIG-11-dUTP,pH7.5）

Klenowenzyme（2U/μL）

绝对酒精

70%酒精

TE（10mMTris-Cl,pH8.0;1mMEDTA）

方法步骤：

◆以下反应条件与步骤主要参照randomprimingkit制造厂商所提供的产品说明书。

1）取100ng模版DNA,加入适量去离子水，把体积补足为15μL.

2）于沸水中加热10min.

◆请记得以夹子固定微量离心管的管盖部份，以免离心管在加热过程中盖子爆开、进水！

3）加热后，迅速把微量离心管移至冰浴中，静置数分钟。

4）离心数秒后，依序加入下列三种试剂：

2μLhexanucleotidemix

2μLdNTPmixture

1μLKlenowenzyme

5）以指头轻弹离心管，以便混合均匀。

6）短暂离心后，置于37℃恒温水槽中作用2h.

◆反应时间至少须要1h,最长可反应过夜。

7）作用完毕的后，加入2μL的0.2MEDTA,以便终止DNA聚合反应。

8）加入2.5μL4MLiCl及75μL纯酒精，混合均匀，置-20℃过夜。

隔天：

1）于13,000rpm,4℃离心15min.

2）倒出上清液，加入50μL的70%酒精，再离心5min.

3）倒出上清液并风干DNA.

4）最后以50μLTE溶解DNA.

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