1）Poligo(dT)-纤维素层析法提取poly(A)⁺RNA

装柱与填柱

1.取oligo(dT)-纤维素0.5～1.0g，用0.1mol/LNaOH重悬。

2.用oligo(dT)-纤维素（0.5～1.0ml柱体积）灌注DEPC处理过的一次性柱子（或塞以无菌玻璃毛的巴式滴管，300℃烘烤灭菌4h）。用3倍柱体积DEPC处理过的水洗涤柱子。

3.用无菌的1×装柱缓冲液（用无菌的DEPC处理过的水稀释2×的贮存液）洗涤柱子，直到流出液的pH值＜8.0。用pH试纸测试。

4.用双蒸灭菌的水溶解RNA，65℃，5min处理溶液。将溶液快速冷却到室温，并加入1倍体积的2×装柱缓冲液。

柱上poly(A)⁺的恢复

5.将RNA溶液加到柱上，并立即用无菌的管子收集流出液。当所有的RNA溶液进入柱子时，用1倍体积的1×装柱缓冲液洗柱，继续收集流出液。

6.当所有的液体流出柱子后，65℃加热收集液5min，重新加到柱子中。再次收集流出液。

7.用5～10倍柱体积的1×装柱缓冲液洗涤柱子，用无菌塑料管（如微量离心管）收集1ml洗涤液。

8.按1：20比例稀释各部分收集液，用石英杯或处理过的异丁烯杯测量260nm出的吸收值，以1×装柱缓冲液作为空白对照。

9.将包含大多数OD₂₆₀物质的部分用2.5倍体积的乙醇沉淀。

从柱中洗脱poly(A)⁺RNA

10.用2～3倍柱体积的无菌、无RNA酶的洗脱缓冲液从oligo(dT)-纤维素柱上洗脱poly(A)⁺RNA。收集相当多于1/2～1/3柱体积的流出液。

11.用石英杯或处理过的异丁烯杯测量各部分收集液在260mn处的吸光值。混合包含洗脱RNA的部分。

RNA的进一步纯化（可选）

经过一轮oligo(dT)-纤维素柱的层析得到的物质通常会包含大约相同数量的多聚腺苷酸和不含多聚腺苷酸的RNA，可以按下面的步骤进一步纯化。

12.为进一步纯化poly(A)⁺RNA，65℃加热准备的RNA3min，然后迅速冷却到室温。用5mol/LNaCl调整洗脱RNA中的NaCl浓度至0.5mol/L，在同一个oligo(dT)-纤维素柱上进行第二轮层析（重复步骤3和5～11）。

13.对于第二轮oligo(dT)-纤维素柱层洗脱下来的poly(A)⁺RNA，加入3mol/L的乙酸钠（pH5.2）至终浓度0.3mol/L。混合均匀。加入2.5倍体积冰冷的乙醇，混合，将该溶液置于冰上至少30min。

14.在10000g（相当于SorvallSS-34转子9000r/min），4℃下离心15min。小心弃掉上清，用70%乙醇洗涤沉淀（通常是不可见的）。稍做离心，吸出上清，将敞口的管子倒置几分钟，使大部分剩余酒精蒸发。不要使沉淀干燥。

15.重新将潮湿的RNA沉淀用小体积的无菌、DEPC处理过的水溶解。用石英杯或处理过的异丁烯杯测量每一部分柱子收集液在260nm处的吸光值。将含有RNA的部分混合。

16.保存制备好的poly(A)⁺RNA。

2）批量层析方法筛选poly(A)⁺RNA

1.在一系列灭菌微量离心管中，将每份总RNA（上限为1mg）样品的体积用TES调整到600μl。封好管口，在65℃加热10min，然后迅速在冰上冷却到0℃。每份样品加75μl（0.1倍体积）5mol/LNaCl。

2.在每管中加50mg(500μl)平衡的oligo(dT)-纤维素，盖好管盖，室温下旋转轮上温育15min。

3.用微量离心机在室温下离心，600～800g（约1500～2500r/min），2min。

4.将上清移到一系列干净的离心管中，置冰上存放。

5.在含oligo(dT)的沉淀中加1ml冰预冷的吸附/洗涤缓冲液。温和旋涡震荡分散沉淀。将盖好盖子的离心管置于旋转轮上，室温下温育2min。

6.室温下，用微量离心机离心，600～800g约1500～2500r/min），2min。弃上清。重复步骤5和6两次。

7.在含oligo(dT)的沉淀中加0.4ml冰预冷的双蒸灭菌水，温和旋涡震荡以重悬沉淀。立即在微量离心机上离心，4℃，2min。

8.小心吸去上清。

9.回收结合的poly(A)⁺RNA：用400μl双蒸灭菌水重悬沉淀，在55℃温育5min，然后4℃离心2min。

10.将上清移至一系列干净的离心管中，重复步骤9两次，合并所有上清。

11.在上清中加0.2倍体积的10mol/L醋酸铵和2.5倍体积的乙醇，在-20℃存放30min。

12.回收沉淀的poly(A)⁺RNA：4℃离心，最大速度，15min。小心弃上清，用70%乙醇洗沉淀，短暂离心，吸去上清，将管盖打开，倒置数分钟，使大部分残留的乙醇挥发。

13.用小体积灭菌的DEPC处理的水溶解RNA。

14.估计RNA浓度。

15.保存样品。（参照《分子克隆试验指南》第三版518页）

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