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实验方法原理 | 限制性内切酶能够特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上,并切割双链DNA。 |
---|---|
实验材料 | 标准pUC19(2686bp) |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1.在200ul的离心管中,按照下表加入试剂(单位:ul),混匀;点动离心将反应液甩至管底。37℃保温2h进行酶切反应。 ![]() 2.反应结束后,加入2ul 10×LoadingBuffer钝化酶活性;(或:65℃,保温20min使酶失活)。 3.电泳检测。 酶切阴性对照:pUC19标样+10×LoadingBuffer2ul 酶切样品:标准pUC19酶切样品10ul+10×LoadingBuffer2ul 4.质粒及酶切样品电泳预期结果。 ![]() |
注意事项 | 影响酶切的因素:在酶切反应中,DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应,一般可通过增加酶的用量,延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应注意的是,过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切(星号活性)。 |
其他 | 可以采用无缝克隆作为替代方案进行基因重组。 |