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| 实验方法原理 | 组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、密度、离心力及介质黏度等。同一离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能使非均一的悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，从而可分批收集各种亚细胞成分。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 新鲜菠菜 试剂、试剂盒 | 氯化钠 仪器、耗材 | 离心机组织捣碎机显微镜天平离心管纱布烧杯量筒滴管载玻片、盖玻片
实验步骤 | 一、实验步骤 1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml0.35mol/LNaCI溶液中，装入组织捣碎机。 2. 利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3~5min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。 5. 将上沾液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞陔）。 6. 将沉淀用0.35mol/LNaCI溶液悬浮。 7. 取叶绿体悬液一消滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 （1）在普通光镜下观察。 （2）在荧光显微镜下观察。 （3）取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再漓加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可以荧光显微镜下观察。 菠菜叶手切片观察用剖须刀将新鲜的嫩菠菜切削一斜面置于载片上，滴加1~2滴0.35mol/LNaCI溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。 （1）在普通光镜下观察。 （2）在荧光显微镜下观察。 （3）用同样方法制片，但滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液染色1min，洗去余液，加盖廾后即町以荧光显微镜下观察。 二、实验结果 1. 叶绿体的分离和观察 （1）普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 （2）以Olympus荧光显微镜为例，在选用B(blue)激发滤片，B双色镜和O530（orange）阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。 （3）加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。 2. 菠菜叶手切片观察 （1）在普通光镜下可以看到三种细胞 ①表面细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。 ②保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。 ③叶肉细胞：为排成栅状的长方形和椭幽形细胞。 叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。 （2）在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。 （3）用吖啶橙染色后，叶绿体则发出枯红色荧光，细胞核町发出绿色荧光，气孔仍为绿色。
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