一、端粒卫星的PCR扩增

1.将引物置于冰上融化后轻轻混匀，稍离心。

2.对于每个标记物，准备12个反应的混合液包括：196μL高压蒸馏水、32.5μL10XPCR缓冲液、9.75μL氯化酶、32.5μLdNTP混合物、正反向引物各2uL和1UTaq酶，在冰上操作和保存。

3.将上述15uLPCR反应混合液加到10uLDNA中，用铝箔胶盖密封96孔板。

4.扩增前将96孔板放到热循环仪上，94°C变性5min。

5.循环条件为94°C、30s，55°C、30s和72°C、45s，共进行35个循环，最后的延伸时间为72°C、7min。样品可在-20°C保存备用。

二、PCR鉴定

1.凝胶电泳：取3uL上样缓冲液与5uLPCR产物混合，上样到含有5mg/mlEB用1XTBE配制的1.5%琼脂糖凝胶上。

2.使用合适的分子质量标准，在100V电压下电泳30min。

3.将电泳后凝胶移到紫外透射反射仪上观察DNA，确保微卫星的正确扩增。

三、扩增产物的凝胶分析

1.按照ABI自动测序仪手册所列方法，把玻璃板和隔板放到指定的盒子里。

2.将3mLLongRanger凝胶溶液和3mL10XTBE混勻，加10.8g尿素，溶解后加去离子水至30mL，用0.45um滤膜过滤。

3.加入150μL,10%的APS和21μLTEMED后倒胶，使凝胶聚合lh。

4.按说明书将凝胶盒装进测序仪。

5.按表2所示在PCR扩增后将等量的每种扩增产物混合在一起（见注释3)。

6.新鲜配制上样混合液：0.5μLGS-400HDROX、1xL上样缓冲液和5ml去离子甲酰胺。

7.将2μLPCR产物混合溶液与3pL上样混合液混匀。

8.90°C变性3min后，快速放到冰上。

9.将样点人胶孔中。

10.应用运行GS36D2400模块搜集数据。

11.按产品手册说明用GeneScan软件进行数据分析。

12.用GenoTyper软件确定等位基因的大小。

注释

1.研究表明：细胞遗传学难以辨认的非平衡易位是导致CT地中海贫血智力障碍综合征（ATR-16[16])、Wolf-Hirchhorn综合征[17]、Miller-Diecker综合征[18]和猫叫综合征（cri-du-chatsyndrome)[19]智力障碍的原因。

2.用此方法可能会出现的问题是如何确定端粒重排导致的表型。当有一个以上的受累子代、端粒重排与智力障碍共分离时这种关系是明确的。在缺乏智力障碍家族史的条件下，当重排涉及以前智力障碍病例缺失的区域，或者当缺失片段非常大时，就可获得端粒重排的生物学效应证据。在其他病例中，确定小端粒重排的致病性可能更加艰难。

3.为了使获得的所有位点峰高一致，可能需要调整每次混合的比率。