酵母双杂交文库筛选介绍

在酵母双杂交系统中，编码诱饵蛋白和靶蛋白的基因分别克隆进BD和AD载体，这样使得待研蛋白可融合表达GAL4DNA结合结构域和GAL4激活结构域。以上的两种载体共转化酵母细胞。如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那么GAL4DNA结合结构域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活lacZ报道基因的表达。最终通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相互作用。

欧易特色

●原装试剂盒、培养基，保证实验质量

●既能提供核体系又能提供膜体系筛库工作 

●既能提供共转又能提供mating筛库服务

●根据每个客户的研究目标和内容灵活定制研究方案

酵母双杂交文库筛选项目流程

酵母双杂交文库筛选样品要求

构建好的BD质粒或者已连到其他载体上的质粒（需提供诱饵基因序列），如果AD文库不是欧易公司构建需额外提供构建好的AD文库质粒或已转到酵母菌的酵母工作液。

常见问题

●2.如何选择共转还是mating的方法进行筛库？
都可以，对于核系统欧易生物这两种筛库方法都有丰富的经验，但是膜系统只有共转一种筛库方法。

●3.如果诱饵基因有自激活怎么办？
如果诱饵基因有自激活现象，建议找出该基因的激活区域，然后将激活区域删除后重新构建BD质粒。

案例展示

研究背景：

Hypoxia-induciblefactors(HIFs)在肝癌的发生发展中发挥着重要的作用。HIFs包括HIF-1ɑ和HIF-1β。其中，相关研究表明HIF-1ɑ的过表达可促进血管生成和肝癌的侵袭。

研究内容：

本研究采用酵母双杂交筛选与HIF-1ɑ互作的蛋白，随后采用realtimePCR、Co-IP、双荧光素酶报告系统、ChIP、细胞侵袭、细胞增殖等进一步验证候选蛋白FTCD与HIF-1ɑ的相互作用，并分析其在肝癌发生发展中所介导的调控网络。研究表明：FTCD可与HIF-1ɑ互作，且FTCD通过hypoxia-HIFsignaling pathway参与肝癌的发生发展。

HIF-1α与FTCD互作

研究结果：

●1.将HIF-1ɑcDNA序列亚克隆至pGBKT7载体，随后将其与HumanLiverMatchmakercDNALibrarypACT2杂交来筛选其互作蛋白。共筛选到53个互作蛋白，其中包括formiminotransferasecyclodeaminase(FTCD)。FTCD被鉴定为肝癌的一个新的bioMarker，因此将FTCD作为后续实验的研究重点。酵母双杂实验验证了HIF-1ɑ与FTCD之间的相互作用。此外，Co-IP也验证了HIF-1ɑ与FTCD之间的相互作用。

●2.为验证FTCD是否是hypoxia-inducedgene，将HepG2,HeLa,A549,293Tcell分别进行低氧处理，并在mRNA和蛋白水平检测FTCD的表达。RealtimePCR和WB结果表明：低氧处理可诱导FTCD的上调表达，且FTCD随着HIF-1ɑ或HIF-2ɑ的下调而下调。

●3.在FTCD的启动区鉴定到hypoxicresponseelement(HRE)，将HRE克隆至荧光素酶报告系统，研究表明：低氧处理可激活FTCD启动子。此外，ChIP分析表明，HIF-1ɑ可与FTCD的HRE结合。这些结果表明：在低氧情况下，HIF-1ɑ可直接调控FTCD的转录。

●4.为验证FTCD是否可调控HIF-1ɑ的转录激活。在低氧环境下，HIF-1ɑ的转录活性随着FTCD敲降而显著降低。此外，在低氧环境下，FTCD的下调：1）显著减低HIF-1ɑ靶基因（Glut1、ENO1、VEGF、LDHA）的表达；2）减少葡萄糖消耗和乳酸产生；3）显著抑制HepG2cells的增殖及侵袭；4）增强HepG2细胞的化疗敏感性。

【欧易合作项目】
转录组学测序、简化基因组测序、基因组重测序、捕获测序、表达谱芯片、miRNA芯片、lncRNA芯片、甲基化检测、酵母文库、微生物、SNP、蛋白定量、蛋白检测、代谢组学、其他（详情请登录欧易生物官方网站查看或电话咨询）
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