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mayitao  /发布时间:1631554202 /浏览量:530   

稳定转染和瞬时转染，细胞转染的步骤基本相同，只是在转染后的细胞处理会不一样。由于瞬时转染只能维持几天，故在转染12～72后就可以在蛋白或基因水平进行相应的检测了。稳转细胞系通常需要通过一些选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 通常构建的载体上有两个抗性基因，如，氨苄青霉素和新霉素。那么建立稳转细胞系时该用哪种抗生素来筛细胞呢？ 很多真核表达质粒上都有两个抗性基因，但一般其中只有一个抗性可以用来筛细胞。其中氨苄青霉素对细胞是没有筛选作用的，这是用于构建克隆时筛选细菌的。所以这种情况下只能用G418。细胞转染后用G418来加压筛选，其原因是在载体上具有新霉素的抗性基因，当载体被转染入细胞后，由于细胞拥有了抗新霉素的特性，因此在用新霉素加压时，阳性细胞就不会被G418杀死。相反，未被转染入载体的阴性细胞由于没有对新霉素的抗性，那么当使用G418加压时，当然就会被杀死。 如图，这个载体就是两个抗性，Amp和neo，但两个抗性的本质区别在哪？Amp是在bla启动子驱动下表达，bla是原核表达启动子。在大肠杆菌可以表达，因此，转化后的质粒用Amp可以筛选到，而不用G418筛选。而neo是在SV40启动子驱动下表达。SV40是真核表达启动子，转入真核细胞表达。所以只有转入载体的细胞才能用G418筛选出来。 当然，不是什么抗生素都可以用于细胞筛选的，得看抗生素作用机理。氯苄青霉素抑制革兰氏阳性细菌细胞壁的形成，对真核生物起不到杀伤作用，因此不能用于细胞筛选。新霉素是一种氨基糖苷类抗生素，作用机制为作用于细菌核糖体的30S亚基，抑制细菌蛋白质正常合成，使细菌细胞膜通透性增强，导致细胞内钾离子、腺嘌呤、核苷酸等重要物质外漏，引起菌体死亡，从而达到杀灭细菌的作用，对真核生物也起不到杀伤作用，因此不能用于细胞筛选！ G418是一种氨基糖苷类似物，在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似，它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。原因是neo是编码3‘磷酸转移酶的基因，它在哺乳动物细胞中表达细菌APH（氨基糖苷类磷酸转移酶）基因将产生分解新霉素和G418的作用。所以这是做稳转是为什么用G418筛选了。 G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。还可以用其他的抗生素吗？ 用于阳性细胞筛选的还可能有潮霉素（标有Hyg),等等。根据载体中所含有的抗性基因进行选择。比如： 1pBlast质粒具有氨苄青霉素和Blast抗性，筛细菌时用氨苄青霉素，筛细胞时用Blast； 2pZeocin质粒具有卡那霉素和Zeocin抗性，筛细菌时用卡那霉素，筛细胞时用Zeocin。

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