一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

蒸馏水

2.酶和酶缓冲液

PCR混合物（可以放在一起冰冻），对于lml反应，包括：200nmol的各种dNTP;1XVent溶液或等价物；2.5umol的MgCl₂；2nmol的各引物

PCR主要混合物（每个反应必须新鲜配置）：lulVentDNA聚合酶或等价物；99ul上述PCR混合物

3.核酸和寡核苷酸

2个PCR引物寡核苷酸

1个杂交寡核苷酸

PCR正对照：10ng全基因组DNA或能产生阳性PCR信号的起始文库组分（见第5步）

4.培养基

LB，1L水中加入：10g蛋白胨、5g酵母抽提物、10gNaCl,用NaOH调节pH至7.5SM,1L水中加入：5.8gNaCl、2gMgS0₄、50ml1mol/LTris-HCl(pH7.5)、5ml2%的明胶。

含10mmol/LMgSO₄的LB

5.特殊设备

琼脂糖凝胶电泳设备，包括溴化乙锭

6.其他

96孔板（CorningCostar)

聚酯封口膜（NalgeNuncInternational)

噬菌斑杂交所需材料

7.载体和细菌菌株

用噬菌体载体构建的DNA库

用于扩增文库的细菌菌株

二、方法

在筛选DNA文库之前，需要测定几个参数来建立有效的实验条件。这些参数如下。

1.PCR条件。用筛库的引物改变退火温度和循环次数，以得到最大量的特异产物。模板的来源可以是将要筛选的文库（10⁶个噬菌体顆粒）或者是1ng的全基因组DNA。在PCR过程中，噬菌体DNA释放作为模板。因此，在反应之前不需要提纯噬菌体DNA。可以使用的典型引物应该产生0.1~1.0kb的产物（16~24个核苷酸长度，50%G+C含量）。如果需要（比如，当用与不同外显子配对、横跨一个大的内含子的引物时），目的序列可能比1kb长，但产物的量可能会减少。

2.确定文库中基因的丰度。用上面所建立的PCR条件，通过改变加入噬菌体的数目定量文库。能产生PCR产物的噬菌体的最小数目就是实验确定的该基因在文库中的丰度。对于一个插入片段平均为20kb的基因组文库来说，要有大于10⁵的复杂度，以确保目的基因至少出现一次。对一个高复杂度的典型文库来说，用10^4~10⁶个噬菌体做模板，可以显示基因在库中的丰度。加入的含有一个或两个目的基因拷贝的噬菌体的数目，应该用作文库筛选。

一旦确定了PCR条件和基因的丰度，就可以按照如下方法进行文库筛选。

1.取0.5ml新鲜的、在LB中过夜培养的细菌培养物，与0.5mlSM混合，加入含有文库的噬菌体，室温温育20min。

2.加入20ml含10mmol/LMgSO₄的LB，按8X8矩阵分装到96孔板中，每孔100ul。将板用聚酯封口膜密封，37°C225r/min振荡培养5~6h,对噬菌体进行扩增。扩增之后，噬菌体的浓度应该增加到大概10⁹个/ml。大概有1/3的培养物能被均分进96孔板，在计算步骤1的加入噬菌体数时应当考虑到这一点。

3.将一排或一列8个孔中的噬菌体（每孔25ul)用多孔移液器混合（参看讨论部分的可变样式）。在这一步中，当取掉封口膜和移液时，一定要特别小心，以避免样品交叉污染。如果想避免交叉污染，可以将板子短暂离心，以帮助清除封口膜上的液体。用聚酯封口膜将板子重新封闭，在4°C可以保存1个月。

4.用蒸馏水按1:1稀释噬菌体，现在噬菌体就可以用作PCR模板了。

5.在24.5ulPCR主要混合物中加入0.5ul的模板（噬菌体），用上面建立的PCR条件进行PCR。每个实验需要有一个负对照（不加模板）和一个正对照（即能产生阳性信号的10ng的总基因组DNA或一小份的起始文库）。

6.通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。用溴化乙锭染胶并拍照（SambrookandRussell2001)。

7.70°C其空干燥凝胶，变性DNA,然后将寡核苷酸探针（末端用32P标记）用标准的DNA杂交条件与干燥的凝胶直接进行杂交，洗涤，然后放射性自显影[这一步的技术细节可以参看Israel(1993)]。用溴化乙锭染色很容易就能看到特异的PCR产物时，这一步是可以选做的，下面会有讨论。也可以用标准技术将DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上后再进行杂交。

笫6步和/或第7步東得的数据应该能鉴定出含有目的基因的亚库（见讨论部分笫一轮的筛选现在就完成了，与起始文库相比阳性亚库中的基因已经被富集了，后续的筛选循环是1~7步的重复，在扩增的亚库噬菌体定量之后就可以进行。

8.通过噬菌斑法确定阳性孔中的噬菌体的量（SambrookandRussell2001)。

9.用约为上一轮数量1/30的噬菌体侵染细菌，开始下一轮的筛选。

10.重复2~9步。