1.准备下列材料

MEF生长培养基

胰酶溶液

无Ca²⁺和Mg²⁺PBS

丝裂霉素C

明胶溶液（0.1%）

150mm组织培养皿

滋养细胞组织培养皿

2.准备一支15ml离心管，加5ml预热（37℃）MEF生长培养基。取一支液氮冻存的MEF细胞，37℃水浴中轻轻振荡，细胞融化后转移到离心管中。

3.离心收集细胞，悬于10mlMEF生长培养基，接种150mm组织培养皿，加MEF生长培养基至25ml。37℃孵育至细胞长满（约2~3天）。

4.细胞长满后加入丝裂霉素C。吸掉培养基，加入新配制的含丝裂霉素C（10μg/ml）的MEF生长培养基。37℃孵育2.5小时。

5.孵育同时准备明胶处理的滋养细胞培养皿。

(1)0.1%明胶溶液覆盖空的组织培养皿底，室温保温15分钟。

(2)倒掉明胶溶液，培养皿晾干，平放待用。

6.去掉培养基，10mlPBS冲洗三次，完全去除丝裂霉素C，加10ml胰酶溶液，37℃孵育5分钟。

7.加3mlMEF生长培养基，吹吸分散细胞，转移至15ml离心管。

8.离心收集细胞，悬于10mlMEF生长培养基，计数细胞。

9.丝裂霉素处理的MEF细胞以合适密度接种明胶包被培养皿。