细胞内示踪研究

材料

试剂

待金纳米颗粒处理的细胞

蒸馏去离子水(ddH20)

乙醇（200proof)(30%、50%、75%、85%、％%*100%)

明胶（B型，Bloomstrength225)

戊二醛(2.5%，溶于0.lmol/L甲次砷酸钠缓冲溶液)

甘氨酸（0.lmol/L)

醛(40%戊二醛)

氯化金(4.34%m/V)

培养基:细胞生长培养基和无血清培养基

四氧化锇(1%溶于0.lmol/L甲次砷酸钠缓冲溶液)

甲次砷酸钠缓冲溶液(〇.lmol/L)

氢氧化钠(〇.lmol/L)

Spurr树脂

柠檬酸钠(1%m/V，新鲜配制)

仪器

Aclar板

铝片

37°C细胞培养箱

冷冻干燥机

6〇°C烘箱

回流冷凝管

250ml圆底烧瓶

6孔组织培养板

透射电子显微镜

超速离心机

超薄切片机

37°C水浴

方法

金纳米颗粒的制备

1.在连接回流冷凝装置的250ml圆底烧瓶中加人99mlddH20。

2.加入230)lJ4.34%(»27V)氣化金溶液，揽伴，加热到回流。

3.加人大约2.-5ml新鲜配制的l%(m/V)柠檬酸钠溶液。

4.加热IOmin，溶液的颜色由灰色变为黑紫色，葡萄酒色，最后深红色。

5.继续加热2〜3min,直到瑢液呈稳定的橘红色。

6.冷却反应液至室温，4°C保存。

7.32000r/min离心分离金纳米颗粒。颗粒的粒径范围为10〜15nm。

蛋白质纳米球包裹金纳米颗粒

8•将200mg明胶溶解在20ml水中，配制l%〇n/V)明胶溶液，在37℃水浴下溶解。

9•将上述制备的金纳米颗粒和明胶溶液在37°C下混合。

10.用O.lmol/LNaOH调节溶液pH至7.0。接着，然后按方案1步骤3〜5制备明胶纳米颗粒。为了制备包裹金纳米颗粒的明胶颗粒，按方案1描述的方法将它们分散在明胶溶液中。

11•离心分离包裹金的明胶纳米颗粒，按方案1步骤6〜8冻干。
细胞培养

12•把Adar板剪成方形，尺寸和6孔板匹配。
减去其中一个小角,用于区分细胞生长面(图3)。

13.加人合适的培养基，在Aclar板种植细胞，37°C培养到50%的细胞密度。细胞接种密度可以为IXlO⁵个每孔;根据细胞生长的快慢，培养24〜48h。

14.将包裹金纳米颗粒的明胶纳米粒重悬于无血清的培养基，37°C和细胞一起培养。

为了确定细胞对纳米颗粒的吞噬时间,可调节培养时间为1〜6h,不同时间点取样,用电镜观测。

15•除去纳米颗粒悬浮液，加入培养基。

16.分时间点制样，按照下面操作制备电镜样品。

电镜样品的制备

17•取出样品浸入2ml2.5%(mA〇的戊二醛中Ih(戊二醛溶于0.lmol/L甲次砷酸钠缓冲溶液)。

18.用0•lmol/L甲次砷酸钠缓冲溶液4°C下清洗样品3次，每次lOmin。

19•用1%（m/v）四氧化锇(溶于O.lm〇l/L二甲砷酸盐缓冲溶液)室温下固定细胞lh,然后用0•lmol/L甲次砷酸钠缓冲溶液清洗3次，每次lOmin。

20.用不同浓度的乙醇依次浸泡细胞，进行脱水处理，乙醇浓度依次为30%、50%、75%、85%和95%,每次浸泡lOmin。

21•室温下用100%乙醇脱水处理lh。

22.用I:1乙醇和Spurr树脂浸润细胞I.5h,接着用100%Spurr树脂包埋2h

23.将带有脱水和树脂包埋细胞的Aclar板置于覆盖Spurr树脂的铝片的底部，60°C烘箱中加热聚合24h。

24•超薄切片Spurr树脂中的样品。