适用平台：

1、IlluminaGenomeAnalyzer

2、Roche454GSTitaniumandFLX

3、ABISOLiD

 

快速、高效定量、可靠的文库定量对于二代测序十分重要

1、过高估计文库的大小，导致数据读取量少，基因组覆盖率低；

2、过低估计文库的大小，导致clusters或多重模板太多，数据质量不高；

 

Real-timePCR与二代测序文库定量

1、只有qPCR可以定量文库中模板的数量，利于emPCR和桥PCR反应；

2、qPCR灵敏度高，可以精确定量，且所需试验材料量极少。

结论:qPCR是二代测序中文库定量的最佳选择。

 

普通qPCR方法的缺点：

1、普通qPCR含有的是野生型Taq酶，而反应体系中的SYBRGreen燃料对其有抑制：

（1）扩增长度大于400bp时，扩增效率降低；

（2）GC或AT含量过高是，扩增效率降低。

2、自制DNA标准品，费时，定量不准，不能保证每个孔的均一性。

 

KAPA二代测序定量试剂盒克服以上缺点：

1、DNA聚合酶是二代酶，对抑制剂不敏感，与DNA结合更好，单位酶扩增效率更高，可以扩增长片段（1kb）和复杂结构的模板；

2、试剂盒中的DNA标准品是专为二代测序平台设计，稳定性高，均一性好。

 

KAPASYBRFASTqPCR试剂盒优点：

1、反应效率高；

2、可扩增AT/GC含量高的模板；

3、高灵敏度和线性特征；

4、动态范围宽

5、重复性强；

6、速度快，且灵敏度与效率高。

美国几大二代测序中心已经开始使用该试剂盒

1、USNextGenerationSequencingCentres(NGSC)

2、BroadInstitute

3、theJointGenomeCentre

4、theJCraigVenterInstitute

5、BeckmannCoulterandUCBerkley