模板的处理：1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；2.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；3.用半根灭菌的牙签（节约，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一个灭菌的1.5毫升离心管，对PCR管和1.5毫升离心管编号；4.PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳；5.对于PCR扩增显现特异性条带的克隆，把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到5毫升YPDZ培养基中，30度培养，8－12小时后提质粒，酶切鉴定确认。PCR反应体系：以TaKaRaTaqDNA聚合酶反应为例，引物为5´AOX1primer，3´AOXprimer：组分20μl体系10xReactionBuffer2.0μldNTP1.6μlPrimer1（20pmol/L）0.5μlPrimer2（20pmol/L）0.5μlddH2O15.2μlTaqDNA聚合酶0.2μlTOTAL20.0μl3.5.3PCR反应条件：初始变性94℃4min1变性94℃30s30个循环退火50~54℃30s延伸72℃30s结束延伸72℃10min1保存4℃1如果筛选的是Mut+，将会出现两条带，一个是目的基因，另一个是2.2kb的AOX1基因，空质粒会出现以下条带（pPICZαA588bp)，将两者的大小加在一起来解释出现的实验结果。我的结果是空载体的有大约580多的条带，但重组子的PCR只有将近1000bp的条带（我的目的基因是400bp），没有2.2kb的条带。

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