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回复:时间:2008-01-20
我刚开始用piece公司的超敏发光剂,开始是一个师兄建议我按照0.5ml a + 0.5ml b + 9ml水,平皿中孵育5分钟,我这样做了,无荧光,压片20分钟也无任何条带。于是不稀释,直接1:1混合后加到膜上,立即就有荧光条带,即使压上片子,也可以看到,我估计荧光至少持续了8分钟。应为我压第3张片子的时候还有荧光。我的上样量为160,80,40,20(做内参).因为师姐说看到荧光应该30秒就有很浓的条带,可我连续压了1分钟,3分钟,均无任何条带和被经,后来我压了8分钟,有条带,估计是压片的过程中反复解开压片盒,造成片子移动,但可以看出来条带是可以的。同一天,同学用了我的发光剂,因为有经验在先,虽然看到条带,仍压片10分钟,条带浓密,无背景。有荧光为何还需要压片这么久呢?不知各位用的时候有无这种情况!
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回复:时间:2008-01-15
我认为可能是你的显影液有问题了。因为只要在其他的东西没有问题的情况下,肉眼直接可见的荧光应该是压5-10s即可显影出来的。只要看见荧光,出条带和那一种发光试剂就没有关系了,主要是后续的步骤。(而且你用的westPico吧,那个其实算不上超敏发光剂,经不起稀释,而且发光也不算很持久,不过对于常规的western实验应该是很经济的一种方式了吧,毕竟性价比较高呢!)建议你重新配制显影液后再显影,因为显影液的寿命比较短,一般来说工作液2-3周就应该更换以保持最佳的显影效果,浓缩液保存期在室温也一般不超过半年。很多实验室都存在显影液“超期服役”的现象,因此显影效果不佳也是必然的。
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回复:时间:2008-01-12
完全同意lee800265的观点。我也认为是显影液的问题。不管什么牌子的ECL,只要看到了荧光,如果压片出不来或者要压很久,那肯定是胶片或者显影定影液的问题了。而且,你a+b直接上膜而不稀释,等于是用10X的ECL了,还是浪费的很。所以建议你看下Pierce的说明书,到底是应该稀释多少倍的。
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回复:时间:2008-01-11
因为用的是自动洗片机,所以显影液和定影液的质量问题我根本不知道。但估计显影液至少是十天以前配的。对于自动洗片机,显影液和定影液怎么处理呢?至于胶片,我菜刚开始做,以前师姐买来的,大半年没用了。他们以前曝光的情况,应该还过的去。
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