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献给初学者:细胞虐我千百遍 我待细胞如初恋_实验方法_
| 实验方法原理 | 细胞内酯酶水解合成的底物萘酚酯(一种萘的衍生物)而释放出萘酚,并迅速与重氮盐偶联结果在酶活性部位有明亮色彩的沉淀物出现. | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 磷酸盐缓冲液六偶氮化新品红苏木素氨水洗液
实验步骤 | 一、实验试剂: (一)底物混合液 (1)0.067mol/L 磷酸盐缓冲液(PH7.6) (2)六偶氮化新品红(hexoliaed new fuchsin)溶液(新鲜配制) ①溶解新品红(new fuchisn)1g于2mol/L盐酸液25ml中,溶液可长期保存。 ②40g/L亚硝酸钠溶液,4℃保存,每周必须新鲜配制,使用前将等体积新品红溶液和40g/L亚硝酸钠溶液混合,反应1min此液好为六偶氮化新品红 ③氯乙酸萘酚AS-D液:取氯乙酸萘酚AS-D(naphtholAS-D hcloroacetate)5mg溶于N,N-二甲基酰胺N,N-dimethformamide)2.5ml中。 ④将氯化萘酚AS-D溶液2.5ml和六偶氮化新品红0.25ml加至0.067mol/L磷酸盐缓冲液47.5ml中测PH值并调节至7.4不需要即可使用。 (二)复染液:取harris苏木素(含少量明矾)复染液100ml,加冰乙酸4ml,混匀。 (三)稀氨水洗液:每100ml蒸馏水中加入浓氨水(28%)0.2-0.3ml混匀。 二、实验操作: 1.将己固定好的血片或骨髓片放入底物混合液中,在高温温1育10min后,用流水冲洗. 2.用复染液复染10min 3.用稀氨水洗液冲洗玻片直至颜色由红变蓝 4.迅速用流水冲洗,空气中干燥后油镜检查。 三、实验结果判定:阳性反应为红色颗粒.定位于胞浆中, 注意事项 | l.氯乙酸萘酚酯酸(NCE)最佳反应PH7.O-7.6之间,它不被氟化钠所抑制. 2.严格遵照操作规程,如增加温度和PH值可导致氯化乙酸萘酚分解,从而在细胞内产生明显的非特异性酯酶反应。 3.除本法采用新品红(newfachsin)外还有人选用坚固紫(fastgarnet,GBC)或坚固蓝(fast blue ,BBN)
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