2021-07-26【求助】同位素杂交中遇到很有挑战的问题！请发动你们的智慧帮帮我

:~)以前都是使用Amersham的NylonN＋膜碱转法做southern，结果一直很好。后来这个型号的膜升级了，说明书上说不能用碱转，原来的版本又停产了，我就打算拿新膜重新实验一下。

共杂了5张膜，其中两张是升级版的NylonN＋，另外两张是Osmonics公司的MAGNA:NylonTransferMembrane，还有一张是之前碱转法杂交过的，结果很好的膜，拿来重复杂交用做阳性对照。
我们按照说明书上用10×SSC转24h，UV焦联800J，洗膜，预杂交6h后用标记了同位素的探针杂交过夜，洗膜40min，用盖格计数器扫描五张膜上计数都很明显，而且膜上不同的部位信号强度不同，当时估计肯定是杂上了，心里挺高兴的。
可是压磷屏24hour后，扫描结果除了五张白白的膜什么也看不到。
现在可以肯定的是：磷屏、同位素和标记试剂盒都没问题（因为用做Northern结果很好）。
这样一来就提出以下几个疑问：
1，如果是转膜的问题，为什么阳性对照那张膜也杂不出来呢？
2，如果是标记探针模板的问题，为什么我们的Marker（λDNA）也杂不出来呢？λDNA做模板应该不会出问题吧。
3，如果是扫描系统的问题为什么别人的都能扫出结果？
4，如果是磷屏坏了，为什么还能看到五张白白的膜，而不是漆黑一片？
5，如果没有杂交上，为什么用计数器扫描时计数都很明显，而且膜上不同的部位信号强度也不同？
6，如果这两种膜不能使用同位素，为什么原来用同位素杂的很好的阳性对照也没有结果呢？

做之前已经仔细的阅读了两种膜的说明书，加之以前的经验，本来感觉是十拿九稳的事。再者说NylonN＋和MAGNA:NylonTransferMembrane这两种膜是不同公司生产的，性质上有一定差别，按道理两种膜都杂不出来的可能行应该很小才对。感觉好像就在压磷屏之后可能出了什么问题，明明是有信号的为什么杂不出来呢？？

希望有经验的朋友帮助分析一下，发表一下意见，不胜感激！