2021-07-29【求助】BCA法蛋白定量步骤（用酶标仪）

1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。2. 完全溶解蛋白标准品，取10微升稀释至100微升 ，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀 释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。3.将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升。4.加适当体积样品到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20微升。5. 各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟。 注：也可以在室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应 会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。6. 测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

我们的方法是这样的事先配好各个浓度的bsa标准品，step1A液和B液按50：1混合，（比如你要测2个样品，可以是6个标准曲线点0，0.05，0.1，0.2，0.5，1mg/ml，加上2个样品，也就是8个孔，做平行就是16孔，那么取A液取16*0.2=3.2ml，B液取64ul混合就ok了）step2每孔加200ul混合液，然后标准曲线孔加入25ul标准品，样品稀释到合适的比例，也加入25ul（如果图省事的话，比如也可以加1ul样品，再加24ul水补齐，加样的时候可能不会太准）step337度孵育30minstep4测od565，附近也行

我也想知道，望有经验的大侠们赐教阿：）

不知道这个对你有没有用

1.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。2.完全溶解蛋白标准品，取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。3.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20微升加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升。4.加适当体积样品到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20微升。5.各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟。注：也可以在室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。6.测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

feiqiulala：加适当体积样品到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20微升。应该是加适当体积样品到96孔板中，补加PBS到20ul，而不是用标准品稀释液补加吧

我们的方法是这样的事先配好各个浓度的bsa标准品，step1A液和B液按50：1混合，（比如你要测2个样品，可以是6个标准曲线点0，0.05，0.1，0.2，0.5，1mg/ml，加上2个样品，也就是8个孔，做平行就是16孔，那么取A液取16*0.2=3.2ml，B液取64ul混合就ok了）step2每孔加200ul混合液，然后标准曲线孔加入25ul标准品，样品稀释到合适的比例，也加入25ul（如果图省事的话，比如也可以加1ul样品，再加24ul水补齐，加样的时候可能不会太准）step337度孵育30minstep4测od565，附近也行

还有就是BCA方法其实是有不少限制因素的，比如蛋白溶液里面有去垢剂，还原剂（DTT，巯基乙醇，）测得数值就很不准据说最好的办法是氨基黑法

BCA对去垢剂的耐受性还是不错的！

补充一小点：最好是先加20ul的蛋白再加200ul的工作液，这样有助于更好的混匀。否则有可能会发现反应完后会分两层，上层呈微紫色，下层颜色不明显。助实验顺利：）

thanksalot!

wangyanli请问用BCA法蛋白定量的步骤（用酶标仪）这个方法太麻烦了，每次都要配BSA样品，还要先做标准曲线，最好能有考马斯比色

混匀的问题，可以在参数中选择快速震荡，30s就可以了做的好的话可以达到4个九

求大神解答，怎么提前确定样品稀释倍数呢？