无缝克隆（SeamlessCloning/In-FusionCloning），区别于传统PCR产物克隆，唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿主菌中的线性质粒（环状）依靠自身酶系将缺口修复。

• 中文名

• 无缝克隆

• 外文名

• SeamlessCloning/In-FusionCloning

• 特点

• 依靠自身酶系将缺口修复

• 类型

• 克隆方法

1. 1技术原理

2. 2过程

3. 3技术特点

基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增，与常规PCR法是相同的。唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密的连在一起而无需酶联，直接用于转化。

传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。

无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体。

1、位点选择灵活：载体任意位置基因克隆；

2、快速简便：省略酶切、割胶回收、酶连等过程，大约1h完成载体构建；

3、精确：不需要增加任何额外的程序；

4、克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；

5、一次进行多片段目的基因的重组；

引物设计方法

操作过程

1.采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；

2、使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增

3、将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到试管中进行重组反应：

buffer-enzym（mix）15uL

线性化载体XuL

PCR片段YuL

ddH2OWuL

Total20uL

4、混匀后在PCR仪中适当温度孵育30-60min，然后转移至冰上；

5、克隆产物直接转化宿主菌，涂平板挑选出阳性克隆子。

应用：

1、片断克隆，片断组装，突变构建；2、基因表达，成膜，小RNA等功能研究；3、蛋白质突变研究；4、应用合成生物学；5、代谢工程，菌株改造。