1．质粒快速鉴定

试剂：

Protoplastingbuffer:

30mMTris-HCl,pH8.00.33ml/1.0M

5mMEDTA0.1ml/0.5M

50mMNaCl0.1ml/5.0M

20%Sucrose5ml/40%

50µg/mlRNAseI50ul/10mg/ml

50µg/mllysozyme50ul/10mg/ml

补水至10ml，-20℃分装保存。

Lysisbuffer:

89mMTris-HCl,pH8.0

89mMboricacid2mlof5×TBE

2.5mMEDTA

2%SDS2mlof10%

5%sucrose1.25mlof40%

0.04%bromphenolblue4mg

补水至10ml，-20℃分装保存。

步骤：

1．将转化后的菌液铺平板，37℃过夜培养。

2．配制0.6--0.7%的琼脂糖TBE胶。

3．用连续加样枪在96孔板中每孔加入10µlPhotoplastingBuffer。

4．用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至含有PhotoplastingBuffer的96孔板中，振荡混匀。

5．用连续加样枪将LysisBuffer上样于凝胶中，每孔4µl，用排枪将细胞与Protoplastingbuffer混合液上样于凝胶中（细胞在Protoplastingbuffer中不宜超过30-40min），并点上Marker。

6．调节电压为20V（小槽）或40V（大槽），电泳15min，使细胞充分裂解，将电压调高到200V，继续电泳1hr，照相。

7．根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

2．菌落PCR

1．取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。

2．用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。

3．依次加入：

10xbuffer2.5

Mgcl₂(25mM)1.8

DNTP(2.5mM)1

T3引物（10pmol）1

T7引物（10pmol）1

Taq酶0.4

total25ul

各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上

4．94℃，2min。

5．94℃4分钟

94℃40秒

53.6℃40秒35个循环

72℃4分钟

72℃10分钟

4℃24小时

6．待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1KbDNAladder。半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

7．将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。

================  蚂蚁淘在线  ================

免责声明：本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容

版权声明：未经蚂蚁淘在线授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用，并注明“来源：蚂蚁淘在线”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。