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5-day-oldlight-grownwild-type(Columbia)(1)andhpr1-1nullmutant(SALK_143584)Arabidopsisthalianaseedlingsweregroundwithapestleina1.5mLtubeondryice(about12seedlingsorenoughtogive~20µLoftissue),anddoublevolume(~40µL)ofNuPAGE2xloADIngbuffer(Invitrogen)wasadded.Aftercentrifugation,20µLofthesupernatantwastransferredtoafreshtubewith2.1µL0.5MDTTandboiledat100°Cfor5minutes.SampleswereloadedontoaNuPAGE10%Bis-Trisgel(Invitrogen)nexttoCruzMarkers(SantaCruzBiotechnology).Afterelectrophoresis,proteinsweretransferredfor30minutesat24VtoaHybondECLnitrocellulosemembrane(AmershamPharmaciaBiotech)usingNuPAGEtransferbuffer(Invitrogen).Theblotwasblockedfor1hat4°Cin8%non-fatdrymilkinTBS-T(blockingbuffer),andincubatedovernightwithagitationat4˚Cwithprimaryantibodies,1:10000dilutedinblockingbuffer.Theantibodysolutionwasdecantedandtheblotwasrinsedtwicefor5mineachat4°Cin8%non-fatdrymilkinTBS-Twithagitation.Theblotwasincubatedwithhorseradishperoxidase-conjugatedanti-rabbitsecondaryantibody(SantaCruzBiotechnology)dilutedto1:5000inblockingbufferfor5hat4°Cwithagitation.Theblotwaswashedthreetimes,for5mineach,withTBS-TanddevelopedwithLumiGLOreagent(CellSignalingTechnology)accordingtothemanufacturersinstructions.Exposuretimewas3seconds. CourtesyofSarahBukhartandBonnieBartel,RiceUniversity,USA
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