重组Ct病毒载体的制备

材料

试剂
琼脂糖

Aprotinin(10mg/ml)

仓鼠幼鼠的肾细胞（BHK-21)

使用BHK-21黏附细胞培养物制备重组SFV和SIN颗粒，用BHK-21悬浮细胞大量制备蛋白质产物。中国仓鼠卵巢细胞（CHOKl)和人胚胎肾细胞（HEK293)可用于表达研究。

帽类似物（m7G[5’]PPP[5’G)

cr胰凝乳蛋白酶，20mg/ml

完全BHK培养基

将Dulbecco’smodifiedF-12培养基和Iscove’smodified培养基I:1混合后，加上4mmol/L

谷氨酸盐和10%胎牛血清（FCS)。

DTT,50mmol/L

DMRIE-C(Invitrogen)

乙醇（70%和95%，V/V)

Opti-MEMI低血清培养基

苯酸：氯仿：异戊醇（25:24:1，V/V/V)

质粒

pSINRep5(Invitrogen)

pSINrep504

SIN辅助载体DH-BB

SIN辅助载体DH-BB(26S)5’SIN(Invitrogen)

所有SIN和SINS助载体都需经过酶切线性化。

pSFVl(S扣I线性化）

pSFV2gen(JVrwI线性化）

pSFV-helper2载体

pSFV-helperS2

pSFV-helperCS219A

将所有SFV载体用I线性化。

PBS

限制性内切核酸酶：JVoZI、JVraI、_PacI、SapI、SfeI、_X7ioI

RNA酶抑制物（10〜50U/ul)

rNTP混合物

10mmol/LrATP

10mmol/LrCTP

10mmol/LrUTP

5mmol/LrGTP

IOXSP6缓冲液

400mmol/LHEPES(pH7.4)

60mmol/L乙酸镁

20mmol/L亚精胺

15XSP6缓冲液

SP6RNA聚合酶（10〜20U/uD

胰酶-EDTA

〇.25%胰酶

lmmol/LEDTA

无RNA酶水

仪器

细胞培养板（6孔、12孔和24孔）

电穿孔管（〇•2cm和0.4cm)

电穿孔仪（BioRadGenePulser)

18•加人aprotinin至终浓度为250ug/ml以终止反应。
激活的SFV颗粒可用于感染