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mayitao
/发布时间:1533505757 /浏览量:25
| 实验方法原理 | IL-1与小鼠胸腺细胞共同培养时，IL-1可刺激小鼠胸腺细胞增殖。进一步通过3H-TdR掺入法或染料摄入法判定小鼠胸腺细胞增殖量，推定IL-1的生物学活性。通过检测IL-1的生物学活性，可了解单核-巨噬细胞等的功能。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 小鼠胸腺细胞 试剂、试剂盒 | FCS-RPMI-1640培养液LPS刀豆蛋白A3H-TdR
实验步骤 | 1. 小鼠巨噬细胞产生IL-1的诱导 （1）常规收集小鼠腹腔巨噬细胞，10%FCS-IMDM培养液悬浮细胞2×106/ml，接种于24孔培养板，0.5ml/well。 （2）每孔加20ug/mlLPS0.15ml，37度，5%CO2孵育36~48小时。 （3）此时培养上清内含巨噬细胞分泌的高水平IL-1，收集培养上清，12000r/min离心15分钟，将上清移入新的1.5ml试管中，-20℃冻存。 2. IL-1的生物学活性测定 （1）胸腺细胞的制备：颈椎脱位处死小鼠，无菌取胸腺至于平皿中，加入5ml10%FCS-IMDM培养液，200目不锈钢网制成单个细胞悬液；1500r/min离心10分钟，再用5%Hank’s液洗涤细胞2次后，重悬于10%FCS-IMDM培养液中，调细胞浓度为1.0×107/ml。 （2）加样：取胸腺细胞加入96孔细胞培养板，0.1ml/well。再加入IL-1待测样品或IL-1标准品，50ul/well，实验孔再加入50ulConA（终浓度0.625ug/ml），同时设培养液对照孔（0.1ml细胞+0.1ml培养液）、ConA对照（0.1ml细胞+50ul培养液+50ulConA），均设3复孔。37度，5%CO2孵育36~60小时。 （3）3H掺入：每孔加1.85×1010 uBq/20ul（0.5uCi/20ul）3H-TdR，继续培养8小时。 （4）测定：多孔细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用β液体闪烁仪测定3H-TdR （5）掺入量（cpm）以净cpm值（实验孔-ConA对照孔cpm值）为纵坐标，对应的不同稀释浓度IL-1标准品为横坐标，在半对数图纸上绘制出标准曲线，再从标准曲线上查出待测样品中的IL-1含量。 注意事项 | 1. 吸取LPS刺激的小鼠巨噬细胞培养上清时，必须离心，以除去细胞及细胞破碎成分。 2. ConA应选择淋巴细胞转化实验的亚剂量，即选择能够激活胸腺细胞，又不引起明显增殖的量，如果ConA过量，则不能有效反应IL-1的刺激活性。
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