基本方案1未致敏T淋巴细胞的活化

材料

备选方案1用抗体激活未致敏的T细胞

这种方法适用于当抗CD3/TCR复合物抗体不能有效结合小鼠辅助细胞上的Fc受体，或其可溶形式不能有效活化T细胞时。值得注意的是，在某种抗体（如抗G7、Thy-I单克隆抗体）很难诱导T细胞增殖反应的情况下，推荐采用基本方案1。

附加材料

PBS(室温和4°C)

用PBS配制lmg/ml纯化的抗CD3或抗TCR单克隆抗体（非特异性活化T细胞)或lmg/ml纯化的抗V卩或抗TCR-yS单克隆抗体（特异性激活T细胞，表
2.11.1)

1.在4ml聚苯乙烯圆锥底离心管中，用无菌室温PBS(不含蛋白质）将lmg/ml无菌的单克隆抗体储存液（表2.11.1)，根据实验需要配制4个浓度的工作液：如lOOug/ml、10ug/ml、1ug/ml、O.lug/ml，临用前配制。

2.加30ul各浓度的抗体工作液（每孔最多结合2〜3ug;最佳浓度通常为10ug/ml)至96孔圆底板中（每种单抗使用一行），用30/xlPBS作为对照孔。

3.盖好板盖，轻拍培养板侧面确保液体完全覆盖孔底。37°C培养90min，或者4°C培养过夜。培养的同时进行下一步操作。

4.同基本方案1中的步骤1〜3,制备反应细胞悬液（可高度纯化，但其中的辅助细胞并不影响实验结果）。

5.每孔加入200ul预冷的PBS洗涤上述抗体包被的培养板孔，在超净台中将培养板反转倒扣于吸水纸上轻拍，除去残余的液体，重复洗涤2或3次，确保除去多余的抗体。

6.在洗好的板中加入准备好的细胞悬液2X10⁵个细胞/(0.2ml•孔）（根据经验来确定，不能用杂交瘤上清）。如果细胞暂时未准备好，可加100MPBS后置4°C保存过夜（加细胞前应去掉PBS)。

7.按基本方案1中的步骤7〜9进行，在培养2〜3d后（进行动力学实验确定最佳时间）加入³HTdR。

备选方案2混合淋巴细胞增殖实验

附加材料

辅助方案1从抗原呈递细胞或刺激细胞悬液中剔除T淋巴细胞

这一方法的主要目的是排除辅助T细胞的影响。纯化和富集抗原呈递细胞的方法见相关章节；单元2.3中介绍的方法未剔除T细胞，因此不推荐使用。

附加材料（其他材料见基本方案1）

与反应T细胞同基因的未免疫小鼠脾细胞

HBSS

低毒兔补体（Cedarlane)，用冰冷无菌的去离子水稀释

抗Thy-l.2单抗（H〇-13-4，ATCCno.TIB99)或抗Thy-l.l单抗（H〇-22-l，ATCCno.TIB100;或其他抗-Thy-I单克隆抗体见CPIM表3.4.1和腹水制

辅助方案2辅助/刺激细胞的灭活

注：当需要检测基因编码的抗原性差异或没有辐射射源时，多数研究者优先采用丝裂霉素C灭活细胞。

丝裂霉素C灭活细胞

附加材料

细胞维持抗原呈递功能；1100〜2000rad辐射后，抗原呈递能力大幅度下降；>2000md灭活的B细胞失去APC功能。而另一方面，巨噬细胞和树突细胞在3000rad照射后依然保持抗原呈递的功能。为确保B细胞不参与应答，一些研究者倾向于采用2000rad。然而，在检测刺激细胞Mls位点抗原时，应采用<1000md的辐射，因为此时B细胞能够更为有效地呈递Mls抗原。另外，Mls应答也可在丝裂霉素C处理后进行检测，处理后的B细胞依然保持抗原呈递的功能。

在转化的细胞株用作抗原呈递或辅助细胞时，需使用高强度的照射从而阻断其增殖。每种细胞株适合的辐射强度需要根据预实验来确定，但至少应达5000rad;某些转化的细胞株可能需要高达10〇〇〇〜20OOOrad，或有些细胞株可能对丝裂霉素C更为敏感。

基本方案2致敏T细胞的活化

材料

在第4天或第5天达到髙峰）。

基本方案3CD4+CD25+T细胞的活化和抑制功能的检测

材料

备选方案3CD4+CD25+T细胞抑制功能的两步法检测：短期活化和扩增

CD4+CD25+T细胞并分析其抑制功能

附加材料