重组杆状病毒转导脊椎动物细胞

材料

杆状病毒（浓缩的高滴度的储备病毒）

细胞（如人肝细胞系；HepG2>，指数生长期细胞
细胞培养液（完全捧养液，无血清培养液和选择培养液)

Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS)

2.7mmol/LKCl

I.5mmol/LKH2PO4

136.9mmol/LNaCl

8.9mmol/LNa2HPO4•7H20

丁酸纳（lmol/L，溶于PBS)(Sigma-Aldrich)

0.2pm滤器过滤除菌

膜蛋白酶-EDTA(Cambrex)

仪器

.细胞培养管

离心管（15ml)

移液管（IOml)

组织培养板（6孔板）

方法

这个方法是基于6孔板培养的细胞上设计的，如果使用的是与6孔板直径不同的多孔板或培养皿，需要相应地调整细胞的密度和试剂的体积。

收取处于指数生长期的细胞

1•除去细胞培养液，用5〜IOml无菌的PBS润洗细胞一次。

2•用胰蛋白酶——EDTA消化细胞，每90mm培养皿大约用lml。

3•将细胞悬液移到一个装有4ml新鲜培养液的15ml离心管子中，室温47〜92g离心5〜7min0

4•除去培养液，用1〜4ml新鲜培养液重悬细胞沉淀。

5.用血球计数板确定细胞密度，将细胞稀释到IXlO⁵〜2X10⁵后接种于6孔板中。

6•每孔加人3ml培养液，将细胞置于加湿的培养箱中培养18〜20h，5%C02,37°C。

准确的细胞密度由细胞的大小和生长率决定，并且需要通过实验来确定。细胞在转导时达到50%〜7〇%的汇合度可以获得好的转导效率。

转导

7•用预热的含有病毒的无血清培养液替换原先的培养液，将细胞和病毒在加湿的培养箱中孵育2h，5%C02。温和的操作杆状病毒。.病毒不能经受剧烈涡旋或反复吹打。

8.吸去含有病毒的培养液，每孔中加人3ml预热的含血清的培养液。继续培养细胞。

9.转导后24〜72h，检查细胞