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question 【求助】求教对于单抗糖型分析的具体纯化和分析方法
本人刚接触单抗的糖型分析领域不久，导师最近让我建立单抗糖型分析的方法。我查阅了一些资料，感觉比较前沿，资料不多，还是有很多具体的问题不是很明白。希望论坛前辈赐教。
我查到的大概步骤是：PNGase F酶切，收集寡糖，2-AB荧光标记，除去多余标记，最后过HILIC分析。
其中酶切和荧光标记也许可以按买到的试剂说明书进行操作，但如何在酶切后收集寡糖以及除去多余标记的具体步骤就不知道了。
还有一个疑问就是有关寡糖标准品怎么用，如何对照。因为我们实验室没有质谱所以应该用标准品进行定性吧。
望不吝赐教。
飞鸟and唐山 2013-11-19
  • 收集寡糖以及除去多余标记，可以用HILIC SPE，Waters有卖的。此外，Waters的网站上有很多糖型分析的应用报告，他们在糖型分析这块技术还是比较成熟的，应该会有帮助的。没有质谱的话，最后可以通过寡糖标准品的保留时间来定性样品中糖型。HILIC柱可以买waters的（比较贵），也可以买岛津的Amide-80（3um的比较好）。如果样品中的糖型没有标准品，只有通过质谱分析了。waters的糖型分析PPT http://d.dxy.cn/detail/6063185，希望有所帮助。
  • 展开引用sunfound 收集寡糖以及除去多余标记，可以用HILIC SPE，Waters有卖的。此外，Waters的网站上有很多糖型分析的应用报告，他们在糖型分析这块技术还是比较成熟的，应该会有帮助的。没有质谱的话，最后可以通过寡糖标准品的保留时间来定性样品中糖型。HILIC柱可以买waters的（比较贵），也可以买岛津的Amide-80（3um的比较好）。如果样品中的糖型没有标准品，只有通过质谱分析了。waters的糖型分析PPT http://d.dxy.cn/detail/6063185，希望有所帮助。...... 非常感谢您的回答。还有两个问题希望得到您的回答1. 酶切后的如何纯化，我查的资料有两种方法：一种是萃取柱；还有一种是加热使蛋白析出，再离心去除蛋白。加热离心的话效果会不会不好，您一般在这一步中是如何纯化的？2. 寡糖标准品一般都是混合物吧。拿它过柱子的话，我要怎么分辨哪个峰是哪种寡糖呢？希望再次得到您的指教，非常感谢。
answer全部回答 （共 3 条）
  • 蛋白质脱糖酶解后，也可以采取有机溶剂沉淀蛋白的方法来除去蛋白(如甲醇等），早期的文献都是这么做的。现在一般会采取HILIC SPE就是您说的萃取柱。最近尝试用超滤管除蛋白效果也不错（超滤管孔径小于蛋白，把蛋白档在超滤膜上），不影响后续2-AB标记。寡糖标准品有单一和混合的，常见的寡糖在http://www.prozyme.com/ 上都能找到，而且是已经标记了2-AB的，可以直接上柱。你可以先分别单独过柱，优化色谱梯度。再把标准品混合，进一步优化梯度，尽量使每个标准品充分分离。附一张我最近跑的标准品色谱图给你做参考。我用的岛津的 Amide-803um 的柱子，主要研究的单克隆抗体上的糖型。
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