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回复:时间:2007-11-20
prettytiger1RTprimer得设计多大呢?TM值有要求吧?由于RT温度相对比较低(37-42),所以RT引物的Tm值也相应降低,Tm不要超过50度,长度以15-20bp为宜(TAKARA说明书上建议12-15bp)。一般PCR引物要求3’最好是G或C,但RT引物建议使用A或T以提高RT效率。prettytigerwrote:2两对巢式PCR的引物直接与合成的环化单链CDNA互补就可以吗?非也,非也!两对引物均为反向PCR引物,而且要注意反向嵌套。prettytigerwrote:3两对巢式PCR的引物长度及TM值有什么要求?长度和TM上可以和普通PCR一致。但避免第一次PCR残留的引物在第二次PCR中产生干扰,最好是第二对引物TM比第一对高一些,3-5度吧。prettytigerwrote:4还有什么注意的事情?太多了,特别是RT引物。RT引物要5’磷酸化;设计再好的RT引物也可能会遇到RNA有二级结构等导致RT失败的因素,所以建议设计2-3条以提高命中率(当然要先摸摸你老板的腰包)。还有TAKARA很黑的,比如3’RACE试剂盒的说明书简直就是误导,就想消费者赶紧用完再买。5’RACE试剂盒也一样,纯化过程一根柱子都不给,叫你用乙醇沉淀。不过这比较便宜,你随便用哪个公司的柱纯化盒都行。
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回复:时间:2007-11-16
我也在做,不过我也不是很懂,但是不同的合成公司或者软件计算出来的TM值都是不一样的,序列既然已经确定,你就不要管他的TM值了,至于特异性引物的TM,就按照说明书上的来就好了,大于70就用程序一,小于就用程序二
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