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实验材料	异丙基β-D-硫代半乳糖苷
试剂、试剂盒	非变性裂解液非变性洗涤液非变性洗脱液苯甲基磺酰氟
仪器、耗材	超声匀浆器聚丙烯柱
实验步骤	3.1非变性条件下重组激酶的纯化 用于磷酸化筛选的激酶必须是可溶和有活性的，且无其他激酶参杂的纯化激酶。因此，我们可以从CDNA表达文库中，大量生产和纯化组氨酸标记的重组蛋白质激酶，这些cDNA表达文库包括，用大肠杆菌载体PQE30NST(检索编号：AF074376；22)构建的大麦表达文库，或用pQE30NASTattB载体（检索编号：AY386205；23；也可见28.3.1)构建的拟南芥表达文库。我们用以下方法从这些文库中表达并纯化蛋白激酶。 表达： (1)在Falcon离心管（50ml)中加入10ml细胞培养基。 (2)将培养物与表达组氨酸标记蛋白激酶的细菌一起接种到培养基中，这些细菌取自于保存于-80°C的384微孔板。 (3)经37°C剧烈摇晃过夜培养后，将细胞培养物转移至含有90ml预热的2YT培养基的300ml三角瓶中，2YT培养基中含100μg/ml氨苄青霉素，15μg/ml卡那霉素。继续培养至OD值达到0.7。 (4)为了诱导蛋白质的表达，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续在37°C培养4h。 (5)将细胞培养物转移至50ml的Falcon离心管中（每种细胞培养物转移到两个离心管中），1900g离心10min，收集细胞，并立即保存于-80℃。 非变性蛋白质纯化（以下步骤均在0~4°C下操作）： (1)取出-80°C冰冻保存的沉淀物，在冰上解冻。 (2)用0.5ml含0.25mg/ml溶菌酶和0.1mmol/LPMSF的裂解液裂解处理细胞。 (3)汇总裂解产物，用设置为一半功率的超声匀浆器在冰浴条件下剪切处理裂解产物中的DNA3次，每次1min。 (4)将裂解产物转移至1.5ml离心管中，20000g，4°C离心30min。 (5)将上清液转移至新的离心管中。 (6)加入250μl的NiNTA-琼脂糖，4°C300r/min振摇1h，以结合组氨酸标记的蛋白质。 (7)将混合物转移至1ml的聚丙烯柱子中。 (8)用10倍体积的非变性洗涤液洗涤柱子。 (9)蛋白质分4步洗脱步骤洗脱，每次洗脱用0.5ml非变性洗脱液。 (10)蛋白质与甘油[终浓度为20%(V/V)]混合后保存于-80℃(见注释1)。我们建议在每一步的离心、裂解、洗涤和洗脱过程中，取小样进行聚丙烯酰胺凝胶(如15%)电泳（图29-1)，检验这些纯化步骤的效率。用Bradford检测方法确定蛋白质浓度[26]。 3.2蛋白质芯片上的激酶检测建议在进行芯片实验之前，先用一个已知的底物作正对照，检测激酶的活性（见注释2，3)。同时还必须排除这个激酶对重组蛋白质对3"或5"端标记物磷酸化作用的可能性，如组氨酸标记（见注释4)。 在此，我们介绍一种激酶检测后的信号分析方法。我们将样品蛋白质和对照（见注释3)用10X10的点样模式（见注释6)，点样在FSAT片基上（见注释5)，每个样品重复点样4次。用于定量分析的点样模式最近已被报道[23]。 激酶检测： (1)将在4°C密封保存的头一天点样的蛋白质芯片（构建方法参见第28章）室温下用TBST剧烈振摇洗涤1h(见注释7)。 (2)用2%BSA/TBST在室温条件下对洗过的芯片进行封闭处理1h。 (3)将封闭处理过的芯片放置在用TBST浸泡过的Whatman滤纸上，这样可以使芯片在接下来的激酶反应过程中不会干燥。 (4)室温下，将芯片置于250μl激酶溶液中孵育1h，激酶溶液包含13μg/ml的CK2α和25μCi/ml放射性标记的[y33-P]ATP(见注释1)。孵育过程要加盖进行。 (5)用TBST洗涤6次，每次30min。 (6)最终，芯片用微量滴定板离心机（如Eppendorf，Hamburg，Germany，产品目录号：5810R)干燥，或者手动吹干，然后转移至X射线盒。 (7)用X射线胶片进行信号检测，将胶片放在芯片上，X射线盒在-80°C保存适当的时间（见注释8)。然后，胶片在暗室中冲洗显影。另一种检测方法是，将胶片曝光于成像板上，然后用磷屏显像仪进行信号检测（见注释8)。 图29-2(左）显示了CK2α磷酸化筛选实验中，芯片对X射线胶片曝光后的典型结果，几个蛋白质的4次重复点样在胶片上给出了不同的信号。 为了确定组氨酸标记的重组蛋白质在芯片上的定位，我们用本书中介绍的（见第28章）一种抗RGS-His6的抗体筛选这些蛋白质。几乎所有点样蛋白质都可以被检测到（约95%)，如图29-2 (右）所示。 3.3潜在激酶靶蛋白的选择 在进行信号分析时，需要这个激酶不同方式的两个独立的实验结果。 潜在激酶靶蛋白的选择标准： (1)在一个实验中如果一个样品的所有4个点样点在X射线胶片或磷屏显像仪上都给出一个相同的信号（图29-2)，那么这个蛋白质被认为是阳性的。 (2)如果在两次实验中都得到了阳性结果，这个蛋白质就被认为是一个可能的靶蛋白。 例如，从接近800个不同的大麦蛋白中鉴定出21个可能的CK2α靶蛋白「22」。最近报道了一种芯片磷酸化后用基于阈值的定量系统筛选潜在靶蛋白的方法。 3.4潜在磷酸化靶蛋白的验证 当使用这种基于芯片的磷酸化方法作为一种离体外鉴定潜在磷酸化靶蛋白质的筛选工具时，这些被鉴定的蛋白质要用其他方法进行验证，包括离体与活体的方法，其中一些方法已在前言中提及。 我们用印迹磷酸化检测来离体验证潜在底物： (1)用SDS-PAGE分离蛋白质，如用15%SDS-PAGE，然后将蛋白质转移到PVDF膜上。转膜后，用考马斯亮蓝染色凝胶，检验蛋白质的转移效率。 (2)用本书中介绍的基于芯片检测的反应条件以及适当的体积，在印迹膜上进行磷酸化反应。 图29-3显示了印迹磷酸化实验的一个经典的例子。我们对在两个芯片实验中用MAP激酶鉴定为潜在底物的48个蛋白质进行验证，几乎所有的蛋白质都得到了确认，如图29-3所示。我们使用与芯片实验相同的阳性对照：不同浓度的髓鞘碱性蛋白(MBP、MAP激酶的人工底物）。阴性对照蛋白用那些在基于芯片的激酶检测中检测到，但还未被鉴定为是潜在底物的蛋白质（图29-3)。 其他的体外验证方法是在溶液中进行的磷酸化检验，应用SDS电泳和放射性自显影检测磷酸化蛋白质[8，23]。Fukunaga和Hunter曾用这种方法来验证用噬菌体cDNA表达文库磷酸化筛选鉴定的激酶底物。