Procedure

1. Dilutep27monoclonalantibody1:1000(v/v)inCarbonateCoatingBuffer.Add100µl/wellandincubateo/n@4°Cor1hr@37°C.
2. Wash3XwithTBST(pourontoplate,emptyintosink,hitontotowel3xtoclearwells).
3. Blockplatebyadding270µl/wellofBSA/TBSsolution.
4. Incubate@37°Cfor1hr.
5. Wash3xwithTBST.
6. Dilutesamplesandstandardsinassaybufferandadd100µl/well(thehighestconcentrationofstandardsisaddedto200µlthenseriallydilutedin100µlassaybufferontheplate).
7. Incubate@RTfor1hrwhileshaking.
8. MeanwhileletTMBsolutionequilibratetoRT.
9. Washplate3xandadd100µl/wellrabbitpolyclonalanti-p27antibodydiluted1:1000inassaybuffer.
10. Incubate1hr@RTwithshaking.
11. Washplate3xandadd100µl/wellanti-rabbitHRPconjugatedantibodydiluted1:1000inassaybuffer.
12. Incubate1hr@RTw/shaking.
13. Wash3xandadd100µl/wellTMB.Allowtodevelopw/oshakingforupto15min.@RT.
14. InactivateTMBwith1NHCLandread@A₄₅₀withTMB-Sprograminaplatereader.

Materials

BSA/TBSTBS+2%w/vBSA

Antibodiesanti-p27monoclonalantibody(BDTransductionLabs,610241)

Rabbitanti-mousep27antibody(Ferolab)

Plates

Nuncimmuno-plate,C96Maxisorp

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