提供商：	广州华银医学检验中心有限公司
服务名称：	miRNA测序
规格：	/sample

    小RNA是一类高度保守的小RNA分子，它可以参与基因表达与调控、RNA的加工与剪切、蛋白质翻译、遗传“入侵”抑制、配子发生等重要生物学过程，是生命活动中必不可少的调控因子。小RNA测序技术采用胶分离技术，收集样本中18-30nt的RNA片段，利用高通量测序技术对样本中所有smallRNA家族进行测序和表达定量，从而解析miRNA、siRNA、piRNA其它非编码RNA等序列，并预测新的小RNA及其靶基因。

1、实验方案
   测序策略：IlluminaNextSeq500 SE50
   数据量：推荐10Mcleanreads

2、技术优势
（1）通量高：一次测序得到上千万条序列；
（2）分辨率高：可以检测小RNA单个碱基的差异；
（3）精准度高：从几个到几十万个拷贝精确计数；
（4）可重复性好：深度测序保证了抽样随机性，重复性好，无需重复实验；
（5）检测范围广：既能鉴定已知小RNA，又能发现新的小RNA。

3、信息分析
3.1标准信息分析
（1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估；
（2）样品间的公共序列和特异序列分析；
（3）小RNA与参考基因组比对分析；
（4）按照优先级将小RNA进行分类注释
（5）NovelSmallRNA预测；
（6）样本间miRNA差异表达分析；
（7）已知miRNA的家族分析；
（8）已知miRNA差异分析（≥2个样本）和聚类分析（≥3个样本）；
（9）已知miRNA和novelmiRNA的靶基因预测；
（10）已知miRNA和novelmiRNA的靶基因GO注释和KEGG通路分析；
（11）novelmiRNA差异分析（≥2个样本）和聚类分析（≥3个样本）；
（12）差异miRNA靶基因预测；
（13）已知miRNA的碱基编辑分析；
3.2高级信息分析
（1）snoRNA注释
（2）piRNA注释
（3）mir2disease注释

4、技术流程


5、案例分析
    案例（1）小鼠早期胚胎发育过程中小RNA的动态变化及其生物学功能
    该研究利用优化的方法系统解析了小鼠卵子到受精后8细胞胚胎发育过程中的小RNA动态变化，发现小鼠卵子和早期胚胎主要包含三类小RNA：endo-siRNA、piRNA和miRNA。受精卵中的这三类小RNA绝大多数来源于卵子，由精子带入卵子的小RNA不足几百分之一。随着胚胎的发育，母源endo-siRNA和piRNA逐渐被缓慢降解。而母源miRNA的降解较快，主要发生在胚胎2细胞期前后。合子中新表达的miRNA最早出现在受精卵第一次分裂前，并随着胚胎的发育持续被激活表达，特别是进化保守的miRNA的表达量迅速上升。研究人员进一步结合小鼠早期胚胎发育的转录组数据进行分析，发现miRNA在卵子到胚胎2细胞期中几乎没有降解靶基因mRNA的功能，而在4-8细胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能开始逐步恢复，并对合子激活表达的基因有明显的靶向抑制作用。以上研究不仅揭示了小鼠早期胚胎发育中miRNA的表达和降解规律，还发现了miRNA对靶基因的调控活性随着胚胎发育而被动态调控的现象，对于理解miRNA在早期胚胎发育中的功能和机制具有重要意义。

图1 卵母细胞和早期胚胎中miRNA表达的动态变化
     案例（2）人前列腺上皮和间质细胞小RNA深度测序展示miRNA的差异类型并首次预测靶点生长因子
    本研究通过高通量测序方法对小RNA长度进行分类，绘制前列腺上皮（PrEC）和间质细胞（PrSC）miRNA图谱。PrEC测序共得到近76Mreads，其中860468条为特异性序列。PrSC测序得到近76Mreads，其中1百万条为特异性序列。鉴定得到许多高度保守及不保守的miRNA家族。与PrEC相比，16条在PrSC中显著高表达的miRNA得到进一步分析。结果表明，这16条miRNA的靶点基因主要涉及附着连接、细胞附着、EGRF、TGF-β和雄激素信号。肿瘤抑制Let-7家族miRNA在两株细胞中高度表达。此外，鉴定得到PrEC和PrSC细胞中特异性表达的miRNA，预测它们的作用靶点为一组转录因子。

图1PrEC和PrSC的小RNA表达聚类分析



图2功能基因重叠


参考文献
[1]Yang etal.Highlysensitivesequencingrevealsdynamic modificationsandactivitiesofsmallRNAsin mouseoocytesandearlyembryos. ScienceAdvances,2016.
[2]Singh etal.DeepsequencingofsmallRNAlibrariesfromhumanprostate epithelialandstromalcellsrevealdistinctpatternofmicroRNAs primarilypredictedtotargetgrowthfactors. CancerLetters,2016.