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回复:时间:2003-06-09
扩增目标基因,纯化后,用分光光度计,定浓度后做为标准品。最好是将此目标基因接入TA克隆,转导入大肠杆菌后扩增,抽质粒,可达1X10十二次方,再以每10倍稀释后作为标准品,一般从1X10八次方开始稀释。标准品一般选六个点,起跳的Ct值最好在20-30之间。另外,标准品及样品要同时重复做2-3管,标准曲线的R值在0.98以上,每10倍稀释的标准品Ct值一般相差3.3左右。
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回复:时间:2003-06-13
我现在在做,两个系统,sybrgreen和taqman。我是用质粒DNA做标准曲线,(测OD,计算copy数,按指数级稀释,从10的0次方到10的5次方,测ct,每次每个样本做两份,比较ct值,去掉可疑数据。这样做大概9次,作出曲线)。以后的样本测出的ct值上标准曲线,得出copy数。我的感觉SYBRGREEN好用,但是不是特异性的。Taqprobe虽然特异,但是比较麻烦。做标准曲线最好用质粒DNA,而不用PCR产物。还有就是PCR的program,我用的SYBRGREEN是95度15分,94度15秒、60度30秒、72度30秒、40个循环。我试过很多基因,用这个程序结果都很好。
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回复:时间:2003-06-10
扩增目标基因,纯化后,用分光光度计,定浓度后做为标准品。最好是将此目标基因接入TA克隆,转导入大肠杆菌后扩增,抽质粒,可达1X10十二次方,再以每10倍稀释后作为标准品,一般从1X10八次方开始稀释。标准品一般选六个点,起跳的Ct值最好在20-30之间。另外,标准品及样品要同时重复做2-3管,标准曲线的R值在0.98以上,每10倍稀释的标准品Ct值一般相差3.3左右。
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