1．固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。BouinS固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。4．烤片：60℃30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存6．脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES1：50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。

DAB法显示过氧化物酶

〔原理〕过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生：AH2（供氢体）+H2O2→A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验可知，有称为复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。

免疫组化染色步骤（以ABC法为例）

溶液的配置：

1.0.1MPBS2000ml：NaCL18g,NaH₂PO₄·2H₂O0.8g,Na₂HPO₄·12H₂O12g.共六份

2.柠檬酸盐缓冲液：

贮存液：0.1M柠檬酸溶液（A）：21.01g柠檬酸+1L蒸馏水

0.1M柠檬酸三钠溶液（B）：29.41g柠檬酸三钠+1L蒸馏水

工作液：9mlA液+41mlB液+450ml蒸馏水→0.01M柠檬酸盐缓冲液

3.0.03%H₂O₂-甲醇：30%H₂O₂0.4ml+400ml纯甲醇→充分混匀

4.20%甘油：80ml纯甘油+320ml蒸馏水

5.稀释抗体：1︰300，1︰400，1︰600（临用前配）

6.酒精的配置

染色步骤：一步法

1.载玻片烤箱中60℃40′。

2.二甲苯Ⅰ，60℃20′(水浴箱中)，二甲苯Ⅱ，室温15′。

3.脱水，100%→95%→85%→75%酒精，每级均为3′。

4.蒸馏水冲洗，PBS5′﹡1

5.微波炉修复抗原：0.01M柠檬酸盐缓冲液，99℃肺20′，心肾12′

6.PBS3′*3

7.0.03%H₂O₂-甲醇，室温20′

8.PBS冲洗，PBS3′*3，甩干或纸巾吸去多余液体（勿碰到组织），PAPPen划境线。

9.blocksolution封闭抗原，室温10′。

10.倾出封闭液，不洗，滴加一抗（60ul），4℃过夜或37℃1～2h。

11.PBS冲洗，3′*3。

12.除去PBS，滴加A增强剂，室温25′。

13.PBS冲洗，3′*3。

14.除去PBS，滴加B剂，室温35′。

15.PBS冲洗，3′*3。同时配置DAB显色剂。

16.除去PBS，DAB显色10′（在显微镜下观察染色程度控制染色时间）。蒸馏水冲洗。

17.复染：苏目素均匀滴加2滴，40′′，蒸馏水冲洗，60℃温水泡半分钟。

18.脱水：75%酒精→85%→95%→100%（3次），每级3′。

19.透明：二甲苯Ⅰ3′，二甲苯Ⅱ3′。

18.封片：中性树脂，加盖玻片（组织部位切勿残留小气泡），60℃0.5h烘干。

结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。

拍照

1.更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。

2.数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉

3.免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。

================  蚂蚁淘在线  ================

免责声明：本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容

版权声明：未经蚂蚁淘在线授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用，并注明“来源：蚂蚁淘在线”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。