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抗原物质

固定剂

固定条件（min）

蛋白质抗原

95%～100%乙醇

室温3～10

酶、激素

丙酮

4℃30

免疫球蛋白

四氯化碳

病毒

丙酮、四氯化碳、无水乙醇

室温5～10或4℃30～60

多糖、细菌等

微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮

室温5～10或4℃30～60

类脂（异嗜性抗原）

10%甲醛，10%佛茂尔（ForMol）

室温3～10

（三）水洗

固定后以冷的0.01Mol/LpH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。

（四）染色

染色分直接染色法与间接染色法。

1．材料与试剂

（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。

（2）0.01Mol/LpH7.4PBS液

（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。

（4）带盖方盘

2．直接染色法

（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30min～45min。

（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。

（3）蒸馏水冲洗。

（4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。

2．间接染色法

（1）检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS3×3ˊ冲洗；⑤H₂O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。

（2）检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。

（五）结果显示

荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。

荧光强度的表示方法如下：

＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。

＋＋：荧光明亮，呈黄绿色。

＋：荧光较弱，但清楚可见。

±：极弱的可疑荧光。

－：无荧光。

（六）标本保存

由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。

保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂（Fluormount）或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。

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