SuccessfulRT-PCRrequiresahighquality,intactRNAtemplate.Usethefollowingguidelinestohelppreparethistemplate:

• TominimizetheactivityofRNasesthatarereleasedduringcelllysis,includeRNaseinhibitorsinthelysismixorusemethodsthatsimultaneouslydisruptcellsandinactivateRNases.

• TakestepstoeliminateallpotentialsourcesofRNasecontaminationfromglassware,plasticware,reagents,etc.

• UseaproductspecificallydesignedfornucleicacidpurificationtopreparestartingtemplateRNA.

• UsepurifiedmRNAastemplate,ratherthantotalRNA.Startingwithpoly(A)+mRNAwillgreatlyincreasethelikelihoodofsuccessfulamplificationofraremRNAs,sincetheproportionofmRNAinatotalRNApreparationisquitelow(typically,1–5%oftotalRNAfromamammaliancell).

• IfusingmRNAastemplate,checktheintegrityofthemRNAbygelelectrophoresisbeforeusingitinRT-PCR.ThemRNAshouldappearasasmearbetweenapprox.500bpand8kb.MostofthemRNAshouldbebetween1.5kband2kb.

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