一材料与设备

1)亲和素-磁珠(SA-PMP)

2)GTC抽提缓冲液:4moL/I,异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，pH:7.1

3)生物素标记的oligo(dT)探针（50pmol/ul)

4)稀释缓冲液：6XSSC，lmmol/LTris-HCl，PH7.4，lOmmoL/LEDTA，0.25%SDS

5)β-巯基乙醇(48.7%)

6)无RNase水

7)20XSSC:67.7gNaCl和44.lg柠檬酸钠溶于400ml去离子水中，用NaOH调pH至7.2,加水至500ml体积，用0.1%DEPC处理过夜，高压灭菌

8)0.5XSSC: 20XSSC用无RNase水稀释而成

9)1XPBS

10)磁架

11)75℃水浴

12)50ml无菌Corex离心管

13)15ml螺旋盖锥形离心管

14)TissuemizerDM或其他同类匀浆器

15)BeckmanJ2-21离心机或其他类似设备


二操作方法

以重量小于0.125的组织中mRNA的纯化为例,大量组织和细胞中mRNA的纯化可参阅相关产品说明书。

1)从冰箱中取出GTC抽提液、生物素标记的oligo(dT)探针、无RNA酶的水及0.5XSSC,平衡至室温并预热稀释液至70℃

2)在50ml无菌螺旋盖锥形离心管屮，首先加入lml抽提液（抽提/BME缓冲液）然后再向其中加人41ulβ-巯基乙醇(48.7%)，保证β-巯基乙醇的终浓度为2%。井将装有缓冲液的管子称重并记录。

3)尽可能快地取得所需量的组织并放人到装有抽提/BME缓冲液的管中，使用小匀浆器髙速匀浆组织至无可见组织块。如果无匀浆器，则可将组织快速切碎，液氮冷冻，在装有液氮的研钵中捣碎研磨。将液氮和组织转移到无菌的50ml螺旋盖锥形管中，液氮挥发后，立即加人抽提/BME缓冲液，使之完全混合

4)将含有组织及抽提/BME缓冲液的骨子称重，减去第2)步中的管重并计算组织块的大小。

5)参考图2.1，根椐第4)步计算的组织块大小决定生物素标记的oligo(dT)探针用量和亲和素-磁珠(SA-PMP)用量。

6)将2ml预热稀释缓冲液加到无菌管中，加入41ulβ-巯基乙醇(48.7%)，终浓度为1%。将此溶液加至匀浆液中.完全混合。再加入第5步确定的探针，晃动以充分混合，并在70°C温育5min

7)转移匀浆液至一清洁无菌的15mlCorex管屮，室温12000g离心1Omim

8)离心时，轻轻晃动使SA-PMP完仝悬浮，将所需量的磁珠转移到一无菌的50ml螺旋盖锥形管中，将此管放置在磁架上。水平放置磁架至磁珠全部聚集在管的一侧。倾斜管子使溶液不流经磁珠表面.小心倒掉储存液

9)用等体积的0.5XSSC悬SA-PMP，用磁架捕捉，按第8步倒掉SSC溶液。重复洗涤两次后，将SA-PMP重悬在初始体积0.5XSSC中。
10)勻浆液离心完成后，小心取出上清，避免吸取沉淀。将已澄清的匀浆液加人含洗涤好的SAPMP的管中，翻转混合

11)将匀浆液及SA-PMP室温孵育用磁架捕捉SAPMP至勻浆液淸澈.按前述方法小心倾去上清液。用一无菌管收集上清液，放在冰上保存直至能肯定mRNA已获得令人满意的结合和洗脱

12)于lml0.5XSSC中宙悬磁珠，再转移到2ml试管中.用磁架捕获磁珠，小心倾去SSC，重复洗涤两遍。最后一次洗后要尽可能多地去除SSC而不搅动SA-PMP。

13)用0.5mL无核酶的水洗脱mRNA，轻振试管重悬SA〜PMP。

14)用磁架捕捉SA-PMP，将洗脱的RNA转移到无蔺小离心管中。用无菌水重悬磁珠，保存在冰中直至mRNA产量和纯度被确定。

15)向洗脱液中加入0.1倍体积的NaAc（用于CDNA克隆)或KAc(用于体外翻译)和1倍体积的异丙醇，放置过夜。

16)于12000g离心lOmin，用lml70?%乙醇重悬RNA沉淀T再离心

17)真空干燥沉淀15min用无RNase的去离子水溶解沉淀。